分子生物学 · 基因组学
DNA 测序方法
核苷酸序列的测定原理与技术演进
正常 dNTP
ddNTP（链终止剂）
荧光信号
光信号
电信号
1 基础概念
什么是 DNA 测序？
DNA测序是用于精确测定DNA分子中核苷酸排列顺序（A、T、C、G）的一系列技术方法。这一能力是现代分子生物学和基因组学的基石。
技术演进路径
经典方法 → 高通量平台 → 实时单分子测序
核心信息
确定四种碱基在基因组中的精确排列顺序
2
Sanger 测序法
链终止法（Chain Termination Method）
▸ 原理
DNA聚合酶以dNTP和荧光标记的ddNTP延伸引物。ddNTP因缺乏3'-OH基团而导致链合成终止，从而产生一系列不同长度的片段。
▸ 工作流程
1 模板DNA（5'→3'）+ 引物
2 DNA聚合酶掺入ddNTP → 链终止
3 产生不同长度的片段集合
4 毛细管凝胶电泳 + 激光检测（色谱图）
荧光色谱图（Chromatogram）
核心特点： 通过片段长度分离确定序列，准确率约99.99%，是小规模、靶向测序的"金标准"。
3
Maxam–Gilbert 测序法
化学裂解法（Chemical Method）
▸ 原理
DNA先在一端进行放射性标记，随后利用不同化学试剂在特定碱基位点发生选择性化学裂解。
▸ 工作流程
1 末端标记DNA（5'→3'）
2
四组化学裂解反应：
G — 硫酸二甲酯 A+G — 甲酸 C — 肼 C+T — 肼+盐
3 凝胶电泳（4条泳道）→ 读取序列
核心特点： 基于特异性化学裂解，准确性高，但所用化学试剂毒性较强，目前较少使用。
▸ 原理
利用高通量平台将数百万条DNA片段同时并行测序，大幅降低了成本并提高了速度，适合全基因组和大规模研究。
▸ Illumina 平台工作流程
1碎片化
DNA
DNA
→
2接头
连接
连接
→
3桥式扩增
簇形成
簇形成
→
4边合成
边测序
边测序
→
5碱基识别
→序列读取
→序列读取
… A T G C T A G C T A G C T A …
核心特点： 大规模平行测序，速度快、准确性高，是全基因组测序及大规模研究的理想选择。
5
Ion Torrent 测序
半导体离子检测
核苷酸掺入时释放 H⁺ 离子，pH值变化由半导体传感器检测，无需荧光或光学检测。
工作流程
1 文库制备 2 乳液PCR（磁珠结合DNA） 3 磁珠装载至半导体芯片孔 4 核苷酸掺入 5 H⁺释放 → 传感器检测 → 读取序列
pH值随时间变化曲线
特点：实时快速测序，无光学系统，可检测pH变化。
6
焦磷酸测序
Pyrosequencing — 光信号检测
核苷酸掺入时释放焦磷酸（PPi），PPi转化为ATP并驱动荧光素酶发光，光信号强度与掺入核苷酸数量成正比。
工作流程
1 单链DNA模板
A T C G 依次流入
3 PPi释放 → 转化为ATP → 发光 4 光强测定 → 读取序列
光强峰值对应核苷酸掺入数量
特点：光信号强度与掺入核苷酸数量成比例，适合短reads和SNP分析。
7
第三代测序（TGS）
长读长测序 — 实时单分子
无需扩增，直接实时读取长DNA片段，是复杂基因组和结构变异分析的重要工具。
PacBio（SMRT测序）
在零模波导孔中实时检测聚合酶活性，通过荧光信号识别碱基掺入。
Oxford Nanopore 测序
DNA穿越纳米孔时，不同碱基导致电流信号的特征性变化，据此识别序列。
特点：长读长（可达Mb级），适合复杂基因组、结构变异及重复区域分析。
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测序方法综合比较
各平台性能指标对比
| 方法 | 读长 | 通量 | 准确率 | 单碱基成本 | 最佳应用场景 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sanger | 500–1000 bp | 低 | ~99.99% | 高 | 小规模靶向测序、验证实验 |
| NGS (Illumina) | 50–300 bp | 极高 | ~99.9% | 低 | 全基因组、转录组测序 |
| Ion Torrent | 200 bp | 高 | ~99% | 中 | 靶向测序panel |
| 焦磷酸测序 | <100 bp | 中 | ~98–99% | 中 | 短reads、SNP分析 |
| PacBio (TGS) | 10 kb–20 kb | 中 | ~90–95% | 高 | 长reads、isoform检测 |
| Nanopore (TGS) | 1 kb–1 Mb | 高 | ~90–95% | 低 | 长reads、结构变异检测 |
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核心概念速查
★
Sanger = 链终止法（ddNTP）
★
NGS = 大规模平行测序，速度快、通量高
★
TGS = 单分子、长读长测序，无需PCR扩增
★
测序读长（Reads） = 短DNA片段的测序结果
★
碱基识别（Base Calling） = 将仪器信号转化为碱基序列的过程
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重点考点
✓
ddNTP缺乏3'-OH → 导致链终止（Sanger法核心）
✓
NGS可在同一时间并行测序数百万条DNA片段
✓
Nanopore通过检测电流中断来识别碱基序列
✓
Sanger测序为实时、单分子检测，无需PCR
✓
Maxam–Gilbert法采用化学裂解原理确定序列
DNA测序方法综述 · 分子生物学基础
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(责任编辑：佳学基因)
