【佳学基因检测】分子诊断与基因检测中的DNA恒温扩增技术及等温扩增技术

 

分子诊断与基因检测两个重要考核指标是检测的灵敏性和特异性。PCR是使用最为广泛的DNA、RNA序列复制技术，以其灵敏性、特异性得到广泛应用，然而PCR需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。

自20世纪90年代初，很多实验室开始发展无需热变性的恒温扩增技术，现已开发出环介导等温扩增技术、链替代等温扩增技术、滚环等温扩增技术、依赖核酸序列等温扩增技术等技术。

环介导等温扩增

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本荣研公司的Notomi等于2000年首先提出来的新的核酸扩增技术。

基于该技术，荣研还曾和国内某公司引起专利纠纷。

其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。

DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。

先确定目标基因上的6个特异性区域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依据这6 个特异性区域设计4条引物（如下图）：

正向内引物(forwardinner primer，FIP)，由F1c 和F2 组成。

反向内引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 组成，中间均以TTTT作为间隔。

外引物F3、B3 分别由目的基因上的F3、B3 区域组成。

在LAMP 反应体系中，内引物的浓度几倍于外引物的浓度。内引物先与模板链结合合成互补链，形成DNA双链。随后外引物再与该模板链结合，形成DNA双链，在BstDNA 聚合酶的作用下，释放出由内引物合成的互补链，该互补链经过一系列反应最终形成具有哑铃结构的DNA单链。

以哑铃结构DNA单链自身为模板不断形成一端开口的过渡性茎环结构DNA，由内外引物引导过渡性茎环结构DNA不断发生链置换延伸反应，最后形成具有多个茎环结构的长度不一的DNA混合物。

环介导等温扩增的优势与不足

LAMP 的优势：

（1）扩增效率高，能够在1h内有效的扩增1-10个拷贝的目的基因，扩增效率为普通PCR的10 倍-100 倍。

（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。

LAMP 的不足：

（1）对引物的要求特别高。

（2）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断。

（3）由于其敏感性强，容易形成气溶胶，造成假阳性，影响检测结果。

链置换扩增

链置换扩增（strand displacement amplification,SDA）是美国学者Walker于1992年首次提出的一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术。

SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。

链置换扩增其原理是基于在靶DNA两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。

被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。

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链置换扩增技术的优势与不足

SDA 的优点：

扩增效率高，反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。

SDA 的不足：

产物不均一，在SDA循环中总要产生一些单、双链产物，用电泳法检测时必然会出现拖尾现象。

滚环核酸扩增

滚环核酸扩增（rolling circle amplification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，指在恒温下以单链环状DNA为模板，在特殊的DNA聚合酶（比如Phi29）的作用下，进行滚环式DNA合成，实现目标基因的扩增。

RCA可分为线性扩增与指数扩增两种形式，线性RCA的效率可达到105倍，而指数RCA的效率可达到109倍。

简单区分，如下图，线性扩增a只用1条引物，指数扩增b则有2条引物。

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线性RCA 又称为单引物RCA，一条引物结合到环状DNA上，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物为单环长度数千倍的大量重复序列的线状单链。

由于线性RCA的产物始终连接在起始引物上，所以信号易于固定是它的一大优势。

指数RCA，也被称作超分支扩增HRCA(Hyper branched RCA)，在指数RCA中，一条引物扩增出RCA产物，第二条引物与RCA产物杂化并延伸，置换已经结合在RCA产物上的下游引物延伸链，反复进行延伸和置换，产生树状的RCA扩增产物。

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以4BaseBio公司的TruePrime滚环扩增试剂盒为例，使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶，实现了无需添加引物即可进行扩增。

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滚环核酸扩增的优势与不足

RCA 的优势：

灵敏度高，特异性好，易操作。

RCA 的不足：

信号检测时的背景问题。在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA 可能产生一些背景信号。

依赖核酸序列的扩增技术

依赖核酸序列的扩增技术（nucleicacid sequence-based amplification, NASBA）是在PCR基础上发展起来的一种新技术，是由1对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温的核酸扩增技术，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，比常规PCR法高1000倍，不需特殊的仪器。

该技术一出现就被用于疾病的快速诊断，目前有不少公司的RNA检测试剂盒都用此方法。

尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术，NASBA相比则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行，相对传统的PCR技术更为稳定、准确。

反应在41摄氏度下，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一对引物来完成。

其过程主要包括：

正向引物包含T7启动子互补序列，反应过程中正向引物与RNA链结合，由AMV酶催化形成DNA-RNA双链。

RNA酶H消化杂交双链中的RNA,保留DNA单链。

在反向引物与AMV酶的作用下形成含有T7启动子序列的DNA双链。

在T7 RNA聚合酶的作用下完成转录过程，产生大量目的RNA。

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NASBA的优势：

（1）它的引物上带有T7启动子序列，而外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，因此该技术具有较高的特异性和灵敏度。

（2）NASBA将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。

NASBA的劣势：

（1）反应成分比较复杂。

（2）需要3种酶使得反应成本较高。

 

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