【佳学基因检测】假性软骨发育不良基因检测案例

【摘要】

假性软骨发育不良（PSACH）是一种罕见的常染色体显性遗传性骨软骨发育障碍，主要表现为短肢型矮小、短指畸形、关节松弛、关节僵硬及疼痛等。该病由COMP基因突变引起，COMP蛋白在胶原纤维形成中发挥关键作用。佳学基因检测通过对两个中国家系进行全外显子组测序（WES），在COMP基因中发现两个新型错义变异：NM_000095.3: c.1319G>T（p.G440V，母方遗传）和NM_000095.3: c.1304A>T（p.D435V，父方嵌合体）。值得关注的是，G440V和D435V均位于同一T3重复基序中，且具有与彼此形成氢键的潜力。经Missense3D和PyMOL进一步分析，证实这两种突变具有破坏COMP蛋白质结构的倾向，从而影响其正常功能。本案例丰富了PSACH遗传学病因的认知，有助于指导临床诊断及遗传咨询。

【关键词】

假性软骨发育不良；COMP基因；全外显子组测序；案例报告；新型错义变异

一、疾病背景

假性软骨发育不良（PSACH，OMIM #177170）是一种罕见的骨骼发育不良疾病，以常染色体显性方式遗传，仅需从单亲遗传一个突变拷贝即可致病。患者通常在出生后2年内生长发育正常，之后生长速度显著减慢，明显低于标准生长曲线。典型临床表现包括短肢型矮小、短指畸形、关节松弛、关节僵硬及疼痛，此外还可出现鸭步步态、膝内翻、肘关节和髋关节活动受限、脊柱侧弯、腰椎前凸和椎管狭窄等。颅面形态及智力发育均不受影响，症状严重程度因人而异。
 
PSACH由COMP基因（MIM 600310）突变引起，COMP蛋白属于血小板反应蛋白家族，参与细胞外基质（ECM）的调控与胶原纤维装配。COMP蛋白包含多个结构域：N端区域、由II型表皮生长因子样重复（T2重复）和III型钙调素样重复（T3重复）构成的中心结构域，以及C端球状结构域（CTD）。其中，T2重复、T3重复和CTD均能与钙离子结合，对蛋白质的正确折叠及功能发挥至关重要。COMP突变导致蛋白质三级结构丧失和错误折叠，使大量COMP滞留于内质网（ER），从而引发骨骼异常，如PSACH或多发性骨骺发育不良（MED）。
 
在PSACH患者中，突变主要集中在T3重复区，CTD区的突变相对少见。研究表明，当变异位于T3重复区时，患者的身材矮小程度可能更为严重。T3重复C型基序中的特定错义变异导致PSACH，而N型基序的错义变异通常引起较轻症的MED。值得注意的是，同一位点的不同突变也可导致不同的疾病严重程度。

二、佳学基因检测方法

2.1 DNA提取与测序

采用DNeasy血液与组织试剂盒（Qiagen）从受检者外周血提取基因组DNA；胎儿DNA来源于羊水样本。使用Agilent SureSelect Human All Exon v.6进行靶向外显子组测序文库构建，在HiSeq X Ten平台（Illumina Inc.）上进行高通量测序，读长比对至NCBI人类参考基因组（hg19/GRCh37），采用GATK流程进行变异识别，ANNOVAR进行变异注释。

2.2 Sanger验证

对发现的候选变异均采用Sanger测序进行验证，确保检测结果的准确可靠。

2.3 蛋白结构预测

利用VarSite、Missense3D及PyMOL对G440V和D435V变异对COMP蛋白结构功能的影响进行系统评估。蛋白质三维结构数据来源于欧洲蛋白质数据库（PDBe）。通过PyMOL对野生型与变异型COMP蛋白的分子结构进行比较分析与可视化。

三、受检家系临床表现

3.1 家系一

先证者为31岁女性，身高135 cm，因身材矮小就诊并寻求遗传与产前诊断。其母亲（身高140 cm）及姐姐（身高142 cm）均表现出相似表型，包括短指畸形、鸭步步态、膝内翻、轻度胸廓变形及肘关节伸展受限，母亲还伴有退行性膝关节病变。所有受累个体颅面形态正常，甲状腺功能检查正常。先证者母亲的X线影像显示手部短指畸形、尺骨远端缩短及膝关节轻度骨关节炎改变，骨盆、椎体及腰椎形态正常，无脊柱侧弯。

3.2 家系二

先证者为28岁女性，身高100 cm，因孕期前来进行产前诊断。其3岁儿子（身高79.5 cm）表现出与母亲相似的临床特征，包括肢体比例失调（短肢）、鸭步步态、膝内翻及肘关节伸展受限。先证者儿子的X线检查显示：手部短指畸形、桡尺骨远端干骺端张开伴骨密度增高；双侧股骨及胫骨长骨骨骺端不规则且粗糙，干骺端增宽，骨骺缩小，关节间隙增宽，膝关节内旋异常；存在脊柱侧弯及椎体舌状突起，未见椎间隙变窄。另见耻骨下支缩短、坐骨-耻骨线宽增加及股骨粗线增宽。先证者父亲除影像学发现关节腔积液外，无明显临床异常表现。
   

临床特征	家系1 I-2	家系1 II-1	家系1 II-2	家系1 II-3	家系2 III-3	家系2 IV-1
性别	女	女	女（先证者）	女	女（先证者）	男
年龄	54岁	26岁	31岁	53岁	28岁	3岁
身高(cm)	140	142	135	160	100	79.5
发病年龄	2岁	2岁	2岁	50岁	2岁	2岁
步态异常	+	+	+	−	+	+
短指畸形	+	+	+	−	+	+
膝内翻	+	+	+	−	+	+
肘关节伸展受限	+	+	+	−	+	+
退行性关节病	+	−	−	+	−	−

 
注：+，表现阳性；−，表现阴性。

四、佳学基因检测遗传分析结果

4.1 家系一：c.1319G>T（p.G440V）变异

在家系一中，佳学基因检测对先证者及其胎儿进行了WES分析，在先证者的COMP基因中发现新型变异NM_000095.3: c.1319G>T（p.G440V）。该变异同样存在于胎儿中，家属决定于妊娠19周终止妊娠。Sanger测序验证显示，该变异与PSACH表型共分离：先证者、其姐姐及母亲均携带杂合COMP突变，而表现正常的父亲则未携带该突变。
 
依据ACMG指南，该变异被判定为可能致病性变异（PM1+PM2_Supporting+PM5+PP1+PP3），理由如下：

• 变异位于血小板反应蛋白III型重复功能域（PM1）；
• gnomAD数据库中未见该变异频率记录（PM2_Supporting）；
• 该位点已报告其他已知致病错义变异，如c.1318G>A（p.Gly440Arg）、c.1318G>C（p.Gly440Arg）及c.1319G>A（p.Gly440Glu）（PM5）；
• 变异与受累家系中的PSACH表型共分离（PP1）；
• 多个生物信息学工具预测该突变对COMP具有有害影响（PP3）。

4.2 家系二：c.1304A>T（p.D435V）变异

在家系二中，Trio-WES分析发现COMP基因中的新型变异NM_000095.3: c.1304A>T（p.D435V）。该变异已于2020年1月提交至ClinVar数据库，由Blueprint Genetics标注为可能致病，但缺乏详细临床背景信息。本家系中，先证者与其儿子均携带该变异，胎儿（IV-2）亦携带，家属决定终止妊娠。Sanger测序证实先证者携带该突变，并确认为父方来源。值得注意的是，先证者父亲仅有关节腔积液而无典型PSACH表型，WES分析显示c.1304A>T在其15%的测序读数中检出，提示其为嵌合体携带者，可解释其较轻的临床表现。
 
该变异依据ACMG指南被判定为可能致病性变异（PM1+PM2_Supporting+PP1+PP3+PP4）。

五、变异对蛋白结构与功能的影响分析

氨基酸残基Gly440与Asp435在不同物种间均高度保守。在gnomAD数据库中，Gly440位点未发现自然变异，已报告的变异（G440G、G440E及本次新发现的G440V）CADD评分均高于25，提示致病可能性大；Asp435的CADD评分为32，亦提示可能有害。
 
Gly440残基原本位于蛋白质的弯曲曲率区，DSSP算法将其二级结构归类为S型。甘氨酸侧链极小，构象灵活性高，常存在于多肽链发生急剧转弯的环区。当任何其他氨基酸取代Gly440时，会增加构象变化所需能量，影响蛋白质整体稳定性，因此被认为是有害替换。
 
Asp435残基位于T3重复区，每个重复序列包含两个DxDxDGxxDxxD基序。Asp残基携带负电荷，能与钙离子结合，对蛋白质结构稳定性至关重要。Asp435与钙离子CA817协同Asp437、Asp439、His441及Asp446共同发挥作用。D435V突变使Asp435失去负电荷，破坏其与CA817的相互作用，进而导致蛋白质去稳定化。此外，Asp435还参与与Gly438和Gly440形成氢键；D435V虽不影响与Gly438的氢键，但会干扰与Gly440的氢键，这一双重破坏（氢键+钙离子结合）或可解释D435V相较于G440V临床表型更为严重的原因。
 
综上，这两种错义突变极可能诱导内质网滞留，通过显性负效应干扰野生型COMP及其他软骨蛋白的正常功能，是导致假性软骨发育不良的重要分子机制。

六、佳学基因检测综合解读

本次检测对两个PSACH中国家系进行了全外显子组测序，发现两个COMP基因新型杂合可能致病性变异（c.1319G>T和c.1304A>T），均位于第六个T3钙结合重复（T36）区域，与既往Briggs等研究建立的基因型–表型关联高度吻合（致病性错义变异主要集中于第6–8型T3钙结合重复，即T36–T38）。
 
本案例检测结果的主要价值体现在以下三个方面：

• 扩展了COMP基因变异谱，为数据库补充了经家系验证的新型致病变异；
• 证实了嵌合体父方（仅有关节腔积液）可将完全外显的PSACH传递给子代，对遗传咨询具有重要提示意义；
• 通过结构分析揭示了T3重复区钙离子结合位点突变破坏蛋白质稳定性的具体机制，为PSACH发病机理研究提供了新证据。

 
佳学基因检测建议，对于临床高度疑似PSACH或MED的患者，可进行COMP基因的靶向测序或全外显子组测序，以明确分子诊断，指导家庭遗传咨询及生育决策。
本报告由佳学基因检测出具，仅供临床参考，最终诊断请结合临床综合判断。

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(责任编辑：佳学基因)