【佳学基因检测】结节性硬化症患者为什么会发生癫痫：基因检测找原因

 

结节性硬化症的基因解码基因检测导读：

结节性硬化症 (TSC) 是一种先天性综合征，基因解码表明，由于两个肿瘤抑制基因 TSC1 或 TSC2 中的一个发生突变，具有这种基因检测结果的个体会在多个器官中广泛产生良性肿瘤。大约 80% 的受影响患者有新的突变，其余 20% 的患者从父母那里继承了结节性硬化症基因突变。根据《神经系统疾病基因检测的大数据分析》，结节性硬化症在没有通过基因检测进行遗传干预的情况下，总体发病率为 6000分之一。皮质结节（Cortical Tubers）是结节性硬化症的神经病理学标志。结节性硬化症最常见的神经系统表现是癫痫、智力低下和自闭症行为。多达 80% 至 90% 的患者会发生癫痫，并且通常难以治愈，对抗惊厥药物的反应较差。
虽然结节性硬化症的基因检测标准已经明确，但对于这种疾病中癫痫的仍然是基因解码的一个重点。在结节性硬化症的基因解码基因检测中，神经系统疾病基因解码师首先总结了已知的结节性硬化症的已知临床表征，重点是其神经学特征。然后，基于结节性硬化症患者和动物模型中结节的分子、病理、免疫组织化学、神经化学和生理特性，基因解码及基因检测小组讨论了结节性硬化症中癫痫发作和癫痫发生的可能机制。最后，佳学基因检测提供了研究数据的归纳总结，以及多学科会诊与治疗小组对结节性硬化症的诊断与治疗的共识性认识，以供三甲医院、患者及医药研究人员研读结节性硬化症中癫痫发生的机制。
2004 年 11 月，来自多个临床和基础神经科学领域的研究人员聚集在纽约市的结节性硬化症 (TSC) 研究人员会议上。这些具有深度研究基础的科学家，包括国际知名神经学家、癫痫学家、电生理学家、解剖学家和神经遗传学家，一起讨论在结节性硬化症中检查癫痫的策略和合作努力的方式和方法。这些际性合作的努力的目的包括：

• 编写TSC的临床、电生理、病理、分子和基因突变的特征；
• 结节性硬化症结节导致癫痫性的理论；
• 为结节性硬化症中人体组织的形态学和基因检测制定标准化检测方案；
• 制定标准化电生理实验方案以解码结节性硬化症癫痫的发生机制。

结节性硬化症的诊断

结节性硬化症是一种遗传性疾病，其特征性疾病表征是在多个器官系统中广泛发展良性肿瘤（称为错构瘤），这些器官包括肾脏、肺、心脏、皮肤和中枢神经系统 (CNS) (表 1 )。 Désiré -Magloire Bourneville (1840–1909) 提出这种疾病的标志是脑回旋结节性硬化症。然而，1835 年 Pierre François Olive Rayer首次描述了结节性硬化症的皮肤病变， Freidrich Daniel 首次描述了心脏横纹肌瘤和皮质结节。
表1：结节性硬化症的临床表现

脑：皮质结节、室管膜下结节 (SEN)、室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA)

眼睛：视网膜错构瘤

心脏：心脏横纹肌瘤

肾脏：良性血管平滑肌脂肪瘤、囊肿、恶性血管平滑肌脂肪瘤、肾细胞癌

肺：淋巴管平滑肌瘤病（LAM），多灶性小结节肺细胞增生

皮肤：低黑色素斑、鲨鱼斑、甲周或甲下纤维瘤、面部血管纤维瘤

行为：智力低下、自闭症、双相情感障碍

中枢神经系统病理表现包括皮质结节、室管膜下结节 (SEN) 和室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA) (图 1 )。结节性硬化症的中枢神经系统的表现是最致残性的，包括癫痫发作、智力迟钝和行为障碍，如自闭症。结节性硬化症的临床特征分为主要特征和次要特征，如表 2所示。主要特征包括对结节性硬化症具有高度特异性的体征，而次要特征的特异性较低。两个主要特征或一个主要加两个次要特征的存在构成了结节性硬化症的明确诊断，而一个主要和一个次要特征表明可能是TSC。一个主要或两个或更多次要特征表明可能存在结节性硬化症。

图1：TSC 的 MRI 特征示例。 (A)室管膜下结节的例子，即所谓的烛状突入侧脑室（箭头）。 （B和C） T ₂加权成像上的皮质块茎（箭头）示例。 (D)矢状 T ₁加权图像上的皮质块茎示例。
表2：结节性硬化症的诊断特点

主要特征	次要特征
1. 皮层结节	1. 牙釉质中多个随机分布的凹坑
2. 室管膜下结节 (SEN)	2.错构瘤性直肠息肉
3. 室管膜下巨细胞星形细胞瘤 (SEGAs)	3. 骨囊肿
4. 色素减退斑（3个或更多）	4. 脑白质径向迁移线
5. 鲨鱼斑（结缔组织痣）	5. 牙龈纤维瘤
6. 面部血管纤维瘤或前额斑块	6. 非肾错构瘤
7. 多发性视网膜结节性错构瘤	7. 视网膜消色斑
8. 非创伤性指甲或甲周纤维瘤	8. 皮肤碎纸屑样 斑
9.心脏横纹肌瘤，单发或多发	9. 多发性肾囊肿
10. 肺淋巴管肌瘤病和/或肾血管平滑肌脂肪瘤

• 明确的结节性硬化症：两个主要或一个主要加两个次要功能。
• 可能是结节性硬化症：一个主要特征加一个次要特征。
• 可能是结节性硬化症：一个主要或两个次要功能。

结节性硬化症的神经学特征

癫痫

癫痫是结节性硬化症中最常见的神经系统症状，60-90% 的被诊断患有结节性硬化症的个体在其一生中发展为癫痫。 96% 的 9-14 岁儿童转诊至儿童神经科诊所的患者发生癫痫发作。在最近一项关于北爱尔兰结节性硬化症患病率的回顾性流行病学研究中，注意到 93.2% 的人患有癫痫症）。然而，在一项对患者进行前瞻性随访的无偏遗传连锁研究中，只有 62% 的患者出现癫痫发作。然而，由于本研究中的患者并未进行全生命周期随访，因此发病率数据可能较低。结节性硬化症中癫痫的发病率数据可能具有误导性，因为许多患有这种疾病的患者可能未被诊断出来。通常情况下，癫痫发作会使患者得到诊断检测，而没有癫痫的结节性硬化症患者可能不会寻求医疗救助。因此，结节性硬化症患者中的癫痫的确切发病率仍然未知。
根据《神经系统疾病的临床表征及基因检测》癫痫发作是67%的结节性硬化症患者的疾病表征之一，并且通常在生命的第一年开始。最常见的癫痫发作类型是复杂的部分性、全身性强直阵挛、肌阵挛和婴儿痉挛。癫痫症通常非常严重，并且在许多情况下是持续的。斯帕拉加纳等人发现87%的结节性硬化症人群患有癫痫症，缓解率仅为 14%。在癫痫发作缓解的患者中，约25%的患者在平均随访5.5年后复发。持续缓解的患者更有可能智力正常，神经影像学上只有少数皮质或皮质下病变，缓解时脑电图相对正常。不良预后体征包括多种癫痫发作类型、一岁前发作的癫痫发作和多灶性脑电图异常。结节性硬化症在临床上面临的一个困难是预测癫痫发作的难治性并在其发生之前进行干预。
婴儿痉挛在患有结节性硬化症的儿童中尤为普遍，TSC 占婴儿痉挛病例的 25%。越来越多的数据表明，TSC 中的婴儿痉挛和相关脑电图发现与经典 West 综合征中的发现有些不同。在结节性硬化症中，局灶性癫痫发作可以先于、共存或演变为婴儿痉挛。首次发现癫痫发作时，最常见的是局灶性或多灶性尖峰的 EEG 特征，随后出现高度节律失常（通常具有局灶性特征）。
TSC儿童的癫痫往往是进行性的，随着时间的推移癫痫发作频率和药物难治性增加。尽管结节性硬化症中存在多灶性结节，因此癫痫病灶具有多灶性，但许多儿童被考虑进行癫痫手术，特别是如果单个结节作为主要病灶。结节切除的成功令人鼓舞，足以保证采取积极的方法。除了脑电图，还可以使用磁共振成像和正电子发射断层扫描 (PET) 扫描来识别致癫痫区域。皮层结节对 PET上 α-[ ¹¹ C]甲基-L-色氨酸 (AMT) 的摄取与接受切除手术的结节性硬化症儿童块茎的致癫痫性密切相关；这种方法可以帮助识别最有可能产生良好手术效果的结节。多模态方法最有助于识别癫痫病灶。手术结果各不相同；最近的一项基因解码报告，17 名接受手术治疗的儿童中有 12 名在中位随访 15 个月时无癫痫发作。然而，在去除有问题的结节后，癫痫发作可能会再次发生。同样，手术切除对认知和行为结果的影响尚不清楚。国际神经性结节基因检测与基因解码研讨会参与者一致认为，预防癫痫性脑病发展的努力至关重要，早期手术可能是实现这一目标的一种方法。

学习障碍和智力低下

智力低下和学习障碍在结节性硬化症中很常见，影响 40% 到 80% 的患者。认知障碍的程度往往是中度或重度。经过基因检测发现具有TSC2基因突变的儿童通常具有更大的认知障碍。结节性硬化症中智商 (IQ) 的分布似乎是双相的，一个峰值在 20 左右，另一个峰值在 80 左右。认知功能障碍的风险在癫痫发作早期、顽固性癫痫发作和婴儿痉挛的儿童中最高，尽管一些这样的孩子有正常的认知发育。在一些研究中，更多的结节与较差的认知能力发育相关，但在其他研究中则不然。多尔蒂等人发现结节数量增加与婴儿痉挛和TSC2基因检测检测到的基因突变有关。
自闭症
自闭症谱系障碍和结节性硬化症的共同发生是公认的。自闭症谱系障碍人群中结节性硬化症的患病率为 1-4%，而自闭症特征存在于 25-50% 的结节性硬化症个体中。与一般人群中男孩患自闭症的比率是女孩的四倍不同，TSC儿童自闭症的发病率在两性之间是相等的。结节性硬化症与自闭症相关的根本原因可能是由于结节性硬化症导致的大脑功能的非特异性破坏，包括结节的位置或癫痫发作及其对大脑发育的影响。在患有自闭症的结节性硬化症儿童中，癫痫发作的年龄明显早于患有结节性硬化症且没有自闭症特征的儿童。然而，没有癫痫发作的结节性硬化症儿童也会出现自闭症。
经过基因检测，如果儿童有TSC2基因突变，则患有结节性硬化症的儿童患自闭症的可能性更大，尽管基因级测有TSC1突变的儿童也会患自闭症。如果孩子有难以控制的早发性婴儿痉挛，特别是如果颞叶有癫痫病灶，则自闭症的可能性更大。新出现的证据与以下观点一致，即颞叶（可能还有其他位置）内的早发性电生理障碍对与社会信息处理有关的关键认知表征的发展和建立产生有害影响，特别是与面部表情和情感上的细微差别。还需要考虑替代机制来解释检查结果。例如，小脑和小脑结构异常在自闭症儿童中的作用已有报道，但这种关联尚未在患有结节性硬化症的自闭症儿童中进行研究。重要的是要确定结节、癫痫发作和自闭症之间是否存在因果关系，以便在早期识别并可能改善处于危险中的途径。

结节性硬化症的基因解码：基因检测科学依据

结节性硬化症影响总体人群中每 6000 人中会有一个人发病。在大约80%的病例中，突变是自发的，而在另外20% 的患者中，突变以常染色体显性遗传的方式从父亲或母亲中遗传而业。通过致病基因鉴定基因解码可以消除或阻断这一类疾病的发生。结节性硬化症是由两种肿瘤抑制基因 TSC1 或 TSC2 中的任何一种突变引起的。这些结节性硬化症基因编码参与控制细胞生长和大小的复杂信号通路的蛋白质。 结节性硬化症致病基因鉴定基因妥码研究的结果表明：TSC1 位于染色体 9q34 上，编码一种新的蛋白质 (hamartin)，该蛋白质含有两个卷曲螺旋结构域。 Hamartin 可以通过 ezrin-radixin- moiesin (ERM) 家族的肌动蛋白结合蛋白调节细胞粘附来抑制肿瘤形成。 TSC2 位于染色体 16p13 上并编码 GTP 酶激活蛋白 (GAP) (结节蛋白)，该蛋白抑制 Ras 相关的小 G 蛋白超家族，例如Rheb (图 2 )。 Hamartin 和 tuberin 形成功能性蛋白质-蛋白质复合物，组成性抑制 mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶点）。 mTOR 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，它接收来自多个信号通路的输入，通过磷酸化关键的翻译调节因子来刺激蛋白质合成，从而增加细胞增殖和生长。 TSC1 的一个重要调节剂是 AKT，它是由三磷酸磷脂酰肌醇激活的强效促生存和促癌蛋白。 AKT 直接磷酸化 TSC2 并抑制其功能。 AKT 通路的一个重要负调节剂是 PTEN（磷脂酰肌醇三磷酸磷酸酶），它减少细胞中的 3'-磷酸肌醇。

图2：参与结节性硬化症的分子途径示意图。 AKT 是一种有效的促生存和促癌蛋白，可被三磷酸磷脂酰肌醇激活。 AKT 通路的一个重要负调节剂是 PTEN（磷脂酰肌醇三磷酸磷酸酶），它减少细胞中的 3'-磷酸肌醇。 AKT 直接磷酸化 TSC2 并抑制其功能。 AKT 对 TSC2 的失活可能会降低 GAB 对Rheb的活性，随后导致 mTOR 的激活。核糖体 S6 激酶 (S6K) 和真核生物起始因子 4E 结合蛋白 1 (4E-BP1) 都是蛋白质翻译的关键调节因子。该途径的下游效应将是翻译、生长、存活和细胞增殖。雷帕霉素是 mTOR 的抑制剂。 （ ↓ ，激活； ⊥ ，抑制；GAP，鸟苷三磷酸酶激活蛋白；PI3K，磷脂酰肌醇-3 激酶；PIP3，磷脂酰肌醇三磷酸；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶标）。
mTor调节 p70S6 激酶和 4E-BP1 的翻译。 p70S6-激酶通过磷酸化核糖体蛋白 S6 来增加核糖体的生物合成。 4E-BP1 是一种真核生物起始因子，通过结合和抑制真核生物翻译起始因子 4E (eIF4E) 充当翻译阻遏物，该因子识别真核生物 mRNA 的 5' 帽。 mTOR 对 4E-BP1 的磷酸化导致 4EBP1 从 eIF4E 解离，从而减轻 4E-BP1 对 eIF4E 依赖性翻译起始的抑制。 eIF4E 过表达通过增加包括细胞周期蛋白 D1、c-MYC 和血管内皮生长因子在内的关键生长促进蛋白子集的翻译来增加细胞生长和转化细胞。 4EB-BP1 和 S6K 的 mTOR 依赖性调节似乎是 mTOR 正调节细胞生长的关键机制。
TSC1（hamartin）或 TSC2（tuberin）功能的丧失导致 mTOR 级联的选择性激活，导致核糖体 S6、p70S6-激酶和 4E-BP1 的 TOR 依赖性增加。 hamartin-tuberin 复合物对该级联的负调节导致生长抑制和细胞大小受限。这些因子调节转录和翻译调节并增加细胞大小。因此，这些基因突变提供了一种合理的机制来解释结节性硬化症中巨细胞的巨细胞特征。除了结节性硬化症基因对 mTOR 通路的调节外，其他独立的细胞信号通路也可能介导结节性硬化症基因的作用。结节性硬化症蛋白也是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 的有效正调节剂，p27 是哺乳动物细胞周期的主要调节剂。
除了它们在控制细胞周期和戴尔损失中的作用外，TSC 蛋白在细胞死亡中也有作用。 Tuberin 抑制 p70S6K 激活 BAD 与 BCL-2 和 BCL-XL 异二聚化以促进细胞凋亡。 TSC2 的突变减弱了这种促凋亡潜力，并可能导致结节的大小。
Rheb是 Ras 超家族的成员，现已被鉴定为结节蛋白下游的特异性 GTP 酶。 Rheb的过表达导致 mTOR 和 S6 磷酸化增加，这被免疫抑制剂药物雷帕霉素阻断。雷帕霉素已被证明可以减少Eker大鼠结节性硬化症模型中的肾脏和垂体肿瘤负荷，并延长此类受影响大鼠的寿命。雷帕霉素目前正在结节性硬化症患者中进行临床试验。在一个由 5 名临床确诊结节性硬化症患者组成的系列中，通过连续 MRI 扫描评估，雷帕霉素在所有病例中均诱导星形细胞瘤消退。
基因解码通过基因检测技术研究了TSC1 和 TSC2 中突变谱和频率。在基因解码研究中的总体突变检测率接近 90%，这表明如果第三个基因座对结节性硬化症表型有贡献，它只占很小比例的病例。在所有系列中，TSC1 突变占已识别突变的少数（约 13%）。 TSC1 突变在散发性结节性硬化症病例中略少见（无家族史，约占所有患者的三分之二），在家族病例中更为常见。 TSC1 突变频率的降低似乎是由于两个基因相对大小的差。与 TSC2 相比 TSC1 中不存在错义和大的缺失突变，以及可能是两个基因的基因组结构或位置。
以前的研究报告了关于 TSC1 与 TSC2 基因检测突变的结节性硬化症患者的神经系统发现严重程度的相互矛盾的结果，但对临床的综合评估224 名结节性硬化症患者的特征表明 TSC2 疾病比 TSC1 疾病更严重，涉及更多的器官系统。这些观察结果与 TSC1 中种系和体细胞突变均不如 TSC2 常见的基因解码模型一致。结节性硬化症表型在 TSC1 和 TSC2 突变中是可变的；最近的一项基因解码记录了几个家族中 TSC2 (R905Q)。
一些结节性硬化症病变已被基因检测证明遵循错构瘤发展的两次打击模型，其中 TSC1 或 TSC2 的一个等位基因中的种系突变由另一个等位基因中的第二个体细胞突变补充，导致细胞生长紊乱和错构瘤形成。对这一模型的支持来自对肾脏血管平滑肌脂肪瘤发展的研究。在 SEGA 中，TSC1 和 TSC2 突变都具有较少的 hamartin 和 tuberin 表达，这与两次打击模型一致，其中给定结节性硬化症基因的两个等位基因必须发生突变才能发生疾病（杂合性丧失，LOH）。 SEGA 可能通过 TSC1 或 TSC2 的双等位基因失活的两次打击机制产生，从而导致 mTOR 激酶的激活。然而，对于结节性硬化症皮质结节，这种致病模型尚未得到证实。已经对皮质结节中的结节蛋白和 hamartin 表达进行了免疫组织化学分析，以检验这一假设，但结果相互矛盾。一些研究报告了皮质结节巨细胞中一种或两种蛋白质的强烈表达，而另一些研究报告了两种蛋白质的表达降低。因此，皮层结节的发病的基因原因仍然是佳学基因解码及国际结节性硬化症继续努力的方向。

结节性硬化症患者中癫痫的病理生理学

结节性硬化症是一种细胞谱系疾病，涉及异常的细胞分化、增殖和迁移。结节性硬化症的神经病理学特征包括皮质结节、室管膜下结节 (SEN) 和室管膜下巨细胞星形细胞瘤(SEGA)。
皮层结节
皮质结节代表结节性硬化症的标志并且是脑结节性硬化症的特征。结节由具有神经元和神经胶质标记蛋白的异常细胞组成，表明它们在发育早期出现。皮质结节在胎儿发育过程中形成，是人类妊娠第 7 周至第 12 周出现的神经增殖障碍。病理学上，结节早在妊娠 20 周就已被发现。结节通过放射学诊断，通常通过 MRI（图 1 ），并通过病理学检查进行验证。皮质结节的数量和定位可能解释了在结节性硬化症患者中观察到的神经表型的差异性。结节通常位于灰质/白质边界；后部定位可能预示着更差的癫痫控制和发育结果。由于结节分布广泛、多发，多个癫痫病灶可以并存。由于结节（或结节周围皮层）被认为是癫痫发作的基质，因此需要详细了解结节的组织病理学、细胞生物学和病理生理学。在许多佳学基因解码正在研究的问题中，正在研究的是癫痫发作是起源于结节内部还是附近，TSC 癫痫发作的病理生理学是否与其他癫痫综合征不同，以及结节的发育如何影响脑回路的成熟。其他佳学基因正在探索的问题包括特定基因突变如何导致结节形成、结节起源的确切细胞以及决定结节发生的位置和数量的因素。
皮质块茎的组织病理学特征包括具有异常细胞形态的皮质的杂乱、错构瘤区域、发育不良的神经元、巨细胞（巨细胞）、异位神经元、异常的树突乔木、异常的轴突投射和星形细胞增殖（图 3 ）。块茎内的巨细胞同时具有神经元和神经胶质标记蛋白。一个重要的概念是，即使在同一个大脑中，块茎也可能彼此不同，这对特定患者块茎的相对致癫痫性有影响。块茎和 SEGA 表现出异质的分化特征，表达神经元增殖 (CRMP4)、迁移 (双皮质素) 和分化 ( HuD和NeuN ) 的蛋白质标志物。结节被认为是静态病变；没有记录到肿瘤的进展。然而，结节可能具有一些动态特征，并且由于髓鞘形成和其他因素，随着时间的推移可能会变得更加突出。块茎致癫痫或仅刺激周围皮层的程度尚不清楚。

图3：TSC 患者皮质结节的显微照片。 (A)皮质块茎的苏木精和伊红染色。异位神经元、异常细胞形态、发育不良神经元和巨细胞（箭头）导致正常皮质层状结构丧失。 (B)皮质结节的银染色显示巨细胞。请注意它们的大而变形的细胞体具有从细胞体异常产生的树突状轴。
众所周知，癫痫发作起源于皮质结节附近，手术切除结节可以减少癫痫发作。结节或结节周围皮层可通过多种可能机制诱发癫痫发作。可能涉及多种机制，但最终，癫痫发作是由于给定皮层区域的兴奋和抑制之间的不平衡而引起的。为了分析这种兴奋/抑制失衡，很容易应用佳学基因解码通常对癫痫病理生理学的概念观点，即膜通道、神经递质受体或突触连接水平的异常，但在结节性硬化症中，主要的病理生理功能障碍可能存在于亚细胞/分子信号通路也是如此。
在结节中，许多特征可能导致致癫痫倾向，包括大脑皮质细胞结构改变、星形胶质细胞增殖、钙化、血管解剖结构改变、水肿、神经递质受体表达改变以及细胞增殖和死亡。特别是，谷氨酸受体控制神经元的兴奋性并受到发育调节。使用细胞特异性标志物在结节中和附近的各种细胞类型（例如神经元、神经胶质细胞、异常发育异常细胞、异位细胞等）上的差异受体表达是阐明结节性硬化症中的兴奋性和致癫痫性的有前途的方法。有利于增加的兴奋，基因检测已显示结节表达 NMDA 受体亚基 NR2B 和 NR2D 的增加。由于抑制作用降低，基因检测显示结节减少了 GABA 合成酶异构体 GAD65、囊泡 GABA 转运蛋白 VGAT 和 GABA 受体亚基 α1 和 α2。当专门分析结节内的发育异常神经元或巨细胞时，发育异常神经元增加了GluR3、GluR4、GluR6、NR2B和NR2C mRNA，而巨细胞上调了NR2D mRNA。在另一项研究中，从患有结节性硬化症的儿童（4-7 岁）身上切除结节。与正常神经元相比，该组织发育不良神经元的树突过程中 GluR1 和 GluR4 表达不成比例地增加，这表明由这些受体亚基改变引起的钙通透性增加可促进癫痫发生增加。总的来说，这些基因解码结果表明，不同的结节成分具有不同的分子谱，这些分子谱可能会导致癫痫发作。
除了分子改变，TSC1 和 TSC2 基因突变导致神经元和树突的结构异常。海马锥体细胞的体细胞大小和树突大小和密度因 TSC1 基因的单拷贝丢失基因检测而受到干扰。 TSC1的缺失导致 AMPA 受体介导的电流增加，这可能有利于增强兴奋和癫痫发作。
尚不确定结节性硬化症中癫痫发作对特定抗癫痫药物的反应是否与癫痫发作的病理生理学有关。例如，TSC 中的婴儿痉挛通常对 GABA 转氨酶抑制剂氨己烯酸有反应，但对其他抗惊厥药，包括改变 GABA 功能的其他药物，反应大幅度降低。
这种对药物干预的不同敏感性可能具有对发病机理的更清晰解码有帮助。结节性硬化症和其他难治性癫痫发作对生酮饮食的反应相似。已发现抗药性蛋白在皮层结节中上调。在三名患有药物难治性癫痫的结节性硬化症患者中，多药耐药蛋白 MDR-1 和 MRP-1 在手术切除的块茎中过度表达，包括在球囊细胞、发育不良神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中。
结节性硬化症研讨会参与者讨论了在结节性硬化症患者中使用多个深度电极来确定癫痫放电是起源于、靠近还是远离给定结节的可行性；这种技术将允许分析癫痫传播的途径。也可以采用刺激方法。染料注射将允许对结节块茎内部和周围的细胞之间特征进行揭示。微透析探针可用于分析结节和结节周围皮质的神经递质敏感性。或者，可以使用光学记录方法来获得类似的信息。虽然这些实验与 AMT-PET 等方法相比,相对来说更具有侵入性，但它们允许在发射模式、放电位置和癫痫风险之间建立直接关联。尚未研究来自手术切除的人体组织的切片培养物或器官培养物。这些技术将允许使用膜片钳记录和并发聚合酶链反应 (PCR)基因检测 在单细胞水平上进行分析，从而使分子遗传异常与细胞放电的生理特征相关联。需要有关蜂窝属性和网络功能的信息。需要通过这些技术研究改进的动物模型来提供机械信息（参见下面的动物模型部分）。
同样，不知道皮质结节如何导致结节性硬化症患者的认知功能障碍。除了结节数量与智商和行为之间的负相关之外，每个结节对结节性硬化症认知功能障碍的影响程度和方式尚不清楚.对结节性硬化症中皮质功能障碍提出的解释之一是皮质结节只是无功能组织的惰性块，通过直接压迫邻近的皮质导致认知障碍和癫痫。或者，由于在早期大脑发育过程中结节中丘脑纤维的正常皮质目标丢失，皮质结节可能会引起丘脑皮质连接的异常连接。这些异常和过度的连接可能会导致皮质的癫痫发作和认知功能障碍，而这些功能在其他方面是正常的。另一种可能性是从结节到周围皮层的连接过度兴奋并导致癫痫易感性增强。在另一种情况下，与结节相邻的功能异常（尽管形态正常）的神经元和神经胶质可能导致致癫痫区和认知障碍。最终，研究皮层块和周围皮层神经元功能状态的最佳方法可能是将严格的生理和行为技术应用于动物模型（见下文）。

结节周围皮层

众所周知，癫痫发作起源于皮质结节附近，而手术切除结节可以减少癫痫发作，引起癫痫发作的可能是周围组织，而不是结节本身。例如，一些患者在结节切除后继续癫痫发作。皮层脑电图和 α-[ ¹¹ C]甲基-L-色氨酸 (AMT) PET 数据表明结节周围组织的致癫痫性虽然没有得到证实，但表明结节附近区域的致癫痫性但不在结节中。然而，这个概念没有可靠的电生理学证实。
结节皮质的组织病理学信息很少，但已假设这些区域在结节性硬化症癫痫发作的产生中起主要作用。结节周围皮质可能由正常的细胞结构组成，或可能表现出轻微的发育异常，例如局灶性皮质发育不良或神经元异位。神经胶质增生或囊性变化也已在病理学上被确定，但它们在癫痫发作发生中的作用尚不确定。细胞间粘附分子-1 (ICAM-1) 是一种在细胞因子信号传导中起作用并被炎症激活的分子，在块茎中增加，但在非结节皮层中没有增加，表明这两个区域之间的免疫组织化学差异可能在癫痫发作中起作用。在结节性硬化症中，异常细胞在整个皮层中的分布可能更加分散，MRI 不一定能识别出来；这种非结节异常可能会扩大通常被认为仅限于结节的致癫痫范围。在这方面，TSC 中的基因突变很普遍，因此如果在没有被结节严重浸润的大脑区域中存在细微的病理生理学，也就不足为奇了。由于文献中的不确定性，研讨会参与者得出结论，不知道结节或周围的非病变组织是否是导致结节性硬化症癫痫发作的原因。

室管膜下结节和室管膜下巨细胞星形细胞瘤

SEN 是排列在脑室表面的良性增生性病变。虽然结节不被认为是渐进的，但 SEN 可能会随着时间而改变。它们可能会生长、钙化或停止生长。最值得关注的是，SEN 可以转变为 SEGA；例如，如果位于Monro孔的 SEGA阻塞脑脊液流动并导致脑积水，这种转变会导致严重的神经功能障碍。其他神经病理学特征包括皮质（跨地幔）发育不良、髓鞘形成、径向迁移线、脑囊肿、半巨脑畸形、脊索瘤和脑膜瘤。 SEN 和 SEGA 通常不被认为是致癫痫的，但它们可能会与邻近组织相互作用以提高兴奋性。

结节性硬化症基因解码的动物模型验证

对结节性硬化症中癫痫发生的理解受到缺乏复制人类疾病病理学的动物模型的限制。理想的动物模型将重现人类结节性硬化症的遗传缺陷、脑结构异常和临床特征。人类结节性硬化症的一些特征由动物模型再现（表 3 ），但对人类状况的洞察可能需要从几种类型的模型中得出。理想情况下，动物模型将用于生成假设驱动的问题，然后将其应用于人体组织。结节性硬化症动物模型的创建由于具有脑回的动物（例如，人类）和具有脑回的动物（例如，啮齿动物）之间的大脑发育的内在差异而变得复杂。其他基本问题可以通过使用更简单的模型系统（例如鱼和苍蝇）来解决。值得注意的是，关于 TSC1 和 TSC2 在调节细胞生长中的作用，尤其是与胰岛素样生长因子受体途径相关的分子生物学，最初是在果蝇中研究出来的。
表3：结节性硬化症动物模型比较

模型	机制	结节	神经病理学	自发性癫痫发作	认知功能障碍
埃克鼠	自发的种系突变	不	大型畸形神经元	不	是的
	一个 TSC2 等位基因的失活	巨大星形细胞瘤
		室管膜下错构瘤
Eker大鼠加氢醌 (HQ)	总部是第 2次命中	不	没有任何	不	未知
埃克大鼠加龄	年龄是第 2次命中	不	大型畸形锥体样细胞（神经元）	不	未知
			巨细胞（星形细胞）
			室管膜下星形细胞瘤
Eker大鼠加辐照	产后照射是第 2次打击	不	发育不良的巨细胞神经元	不;氟乙基诱发癫痫发作的阈值较低	未知
TSC1 条件性敲除 (GFAP- cre )	↑ MAPK表达与功能	不	巨大的星形胶质细胞样细胞 ↑ 星形胶质细胞数	一些	未知
	星形胶质细胞谷氨酸转运受损	海马神经元解体
	受损的星形胶质细胞钾电流 ( Kir )
TSC1 条件性敲除 ( Syncre )	改变的谷氨酸受体亚基	不	↑ 星形胶质细胞数	许多	未知
		海马神经元解体

埃克鼠

迄今为止，TSC 最常用的动物模型是Eker大鼠。 Eker大鼠是一种自发的种系突变，其中一个 TSC2 等位基因失活。因此， Eker大鼠在功能上是杂合的，每个细胞都具有一个异常等位基因。这种突变导致 TSC2 基因产物结节素异常，它是一种 GTP 激活蛋白。 Eker大鼠出现肾肿瘤，但人类结节性硬化症的神经病理学特征难以证实。尽管Eker大鼠有 SENs，但只有一只Eker大鼠被证明具有典型的皮质结节。在使用杂合Eker大鼠的几十年研究中，已报道了最小的神经功能缺损。 Eker大鼠有两种遗传背景——Fisher 和 Long-Evans。
TSC 发病机制的一种理论援引“第二次打击假说”，即最初的种系突变与第二次体细胞突变复合。最近的两项研究在Eker大鼠中使用了第二次打击，试图创建一个更真实的结节性硬化症模型。 Takahashi 及其同事将具有TSC2 ^+/-基因型的怀孕大鼠暴露于对苯二酚，这是一种已知会在Eker携带者中产生肾癌的致癌物质。与 TSC2 ^+/+同胞相比，在 P14 或 P28 处死的TSC2 ^Ek/+后代没有组织学异常。因此，对苯二酚不会复制人类结节性硬化症的神经病理学。作者接下来检查了老年Eker大鼠，其中高龄被认为是第二次打击。在这些老年大鼠中，一些组织学特征类似于人类结节性硬化症病理学，包括深皮质层中的大型畸形锥体神经元（对神经元标志物具有免疫反应性）、异常巨细胞细胞（对神经胶质标志物具有免疫反应性）和部分老年大鼠的神经胶质瘤。非结节皮层中这些异常细胞的存在表明它们可能形成一个异常兴奋的网络，可能是癫痫发作的基础。这些大鼠都没有癫痫发作，但这没有系统地分析。作者计划在体外检查这些Eker大鼠的组织，以探索它们的致癫痫特性，但指出异常神经元的稀缺性将使电生理识别和记录相当具有挑战性。也许必须存在大量此类畸形神经元件才能产生癫痫发作。该模型对人类结节性硬化症的有效性可能受到限制。在人类中，TSC 表现不一定会随着年龄的增长而累积，甚至会出现在非常年轻的患者身上。然而，本文首次证明Eker大鼠至少具有一些与人类相似的神经病理学底物。
Wenzel 及其同事使用不同的方法，使用产后早期照射 (P0-P3) 作为第二次打击。在 TSC2 ^+/- Eker大鼠，但不是野生型大鼠，辐照导致较小的齿状颗粒细胞层。 Eker大鼠表现出畸形的大神经元、巨大的星形胶质细胞样细胞和室管膜下错构瘤，而未照射的Eker大鼠或照射的野生型大鼠中均不存在这些。然而，没有发现皮质结节或 SEGA。在错构瘤病变中，细胞具有神经元和神经胶质特征并表达结节蛋白。最有趣的是，与未受辐射的Eker大鼠和受辐射的野生型大鼠相比，接受早期辐射暴露的 Eker 大鼠对氟乙基诱发的癫痫发作的潜伏期更短（尽管后者没有完全达到统计学意义）。没有一只大鼠出现自发性癫痫发作。这些结果表明，受照射的Eker大鼠具有结节性硬化症的许多神经病理学特征和过度兴奋网络活动的倾向，使其成为研究TSC癫痫发生的有吸引力的潜在模型。
这两个报告表明， Eker大鼠的第二次打击模型可能为结节性硬化症中的癫痫提供一些见解。缺乏典型的结节形成限制了它们对结节性硬化症的普遍性，但Eker大鼠确实表现出让人想起结节性硬化症的神经病理学特征。这些或其他第二次打击是否会使动物更容易癫痫发作仍有待澄清。
动物模型也可用于研究结节性硬化症认知障碍的详细机制。在结节性硬化症模型中唯一的认知研究中， Eker大鼠 (TSC2 ^+/- ) 在两种空间学习范式中进行了测试，即莫里斯水迷宫和径向臂迷宫。在使用这些迷宫的标准方案中， Eker和野生型大鼠的表现同样出色。但是，当使用测试方案的变体来测试情景样记忆时，令人惊讶的是， Eker大鼠的表现优于野生型大鼠。作者将他们的结果归因于 TSC2 突变诱导的有丝分裂原相关蛋白激酶 (MAPK) 信号的改变，这是最佳海马依赖性情景记忆所必需的 ，并且在 TSC2 ^+/-大鼠中是异常的。此外，本研究中的Eker大鼠增强了戊四唑诱导的激发。此外，来自Eker大鼠的海马切片显着降低了长期增强 (LTP) 和长期抑制 (LTD)，表明这些结节性硬化症突变体对突触的能力可塑性明显受损。因此，这些初步但有趣的结果表明，在这个结节性硬化症模型中，即使在没有结构异常（例如结节）和频繁自发性癫痫发作的情况下，认知变化、活动依赖性可塑性和癫痫发作易感性也会发生改变。

TSC转基因动物

通过靶向缺失 TSC1 或 TSC2 基因创建了一些结节性硬化症动物模型。纯合的结节性硬化症基因突变在胚胎发生过程中通常是致命的，而结节性硬化症基因杂合的动物会发展为肾、肝和肺肿瘤，但很少揭示人类结节性硬化症的典型神经病理学。然而，星形胶质细胞中TSC1基因的条件性失活会产生可存活的癫痫小鼠。
正如基因解码研究人所讨论的，目前可用的结节性硬化症转基因模型中没有一个显示出皮质结节，这可能是由于啮齿动物模型中缺乏脑回。
已经使用 Cre-Lox 技术创建了两只 TSC1 条件性敲除小鼠，Cre 重组酶的表达在神经胶质或神经元启动子的控制下。使用胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 启动子产生的基因敲除小鼠的大脑表现出增加的蛋白质波形蛋白和脑脂质结合蛋白的表达，这两种标记物都是胶质前体，支持它们的胶质遗传。在这些条件性敲除 TSC1 (TSC1 ^GFAP ) 的动物中，可以看到异常的细胞病理学，包括海马组织紊乱、星形胶质细胞增殖和皮质分层异常。然而，尚未报道典型的皮层结节。 TSC1 ^GFAP条件性敲除小鼠在两个月大时表现出自发的电图和临床癫痫发作。对这些动物癫痫发作可能机制的研究表明，来自 TSC1 条件性敲除小鼠的星形胶质细胞改变了胶质谷氨酸转运，GLT-1 和 GLAST 蛋白表达降低。此外，这些小鼠的海马切片降低了谷氨酸转运电流。该模型中的其他近期工作指出，星形胶质细胞通过内向整流钾 ( Kir ) 通道吸收钾可能会受到损害。培养的 TSC1 缺陷型星形胶质细胞表现出Kir电流减少和特定Kir通道蛋白亚基的表达减少。来自这些基因敲除小鼠的海马切片减少了星形胶质细胞的Kir电流，并增加了对钾诱导的癫痫样爆发的易感性。具有潜在临床意义的是， Kir信号传导的损伤不受雷帕霉素抑制 mTOR/S6K通路的影响，但通过降低细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2) 活性而被逆转。这些数据暗示了结节性硬化症条件性敲除小鼠神经元兴奋性中异常的星形胶质细胞钾缓冲和谷氨酸转运受损。此外，来自 TSC1 ^GFAP条件性敲除小鼠的海马切片中的长时程增强 (LTP) 受损。在海马体和新皮质中都观察到神经元死亡，这暗示了这些突变小鼠的癫痫发生中兴奋性毒性细胞死亡的作用。
第二个TSC1条件性敲除小鼠模型使用 Cre 重组酶和神经元特异性启动子（突触蛋白）靶向神经元。神经病理学显示巨细胞细胞对神经元标志物呈阳性。 Synapsin-TSC1 条件性敲除小鼠发展为处理诱导的全身强直-阵挛性癫痫发作。从浸泡在低浓度荷包牡丹碱中的 TSC1 突变体的皮质切片获得的现场记录数据显示，延长的场 EPSP、多尖峰活动和自发性癫痫样放电。该模型中的兴奋性可能与巨细胞细胞中 AMPA 和 NMDA 受体亚基表达的改变有关，包括钙通透性增强的 AMPA 亚基，这将有利于癫痫发生。具有临床意义的是，与未经治疗的小鼠相比，用雷帕霉素治疗的 synapsin-TSC1 条件性敲除小鼠的生存期延长。
所有这些结果与人类 TSC的相关性仍有待确定。结节性硬化症基因解码人员对最近大量的结节性硬化症模型表示欢迎，但仍对与人类结节性硬化症的直接相关性持谨慎态度。尽管这些模型中有多种神经病理学，但没有一个表达典型的皮质块茎。

未来发展方向

结节性硬化症分析人员的一致结论是，在基因解码基因检测了解癫痫在这种疾病中的机制并更有效地治疗结节性硬化症患者之前，需要更多关于结节性硬化症的基础和临床科学的信息。基因解码还同意，多中心方案是获取结节性硬化症中癫痫分子和生理基础信息的最快捷方式。这种合作研究将侧重于人类受试者，需要术前选择患者，在不同水平（EEG、细胞外，可能是细胞内）利用电生理技术进行术中研究，以及获取结节和结节周围组织以进行后续分子和生理分析。其中一些信息列于表 4中。这样的多中心研究虽然繁琐，但会产生有关结节性硬化症癫痫发病机制和治疗潜力的关键信息。
表 4.更好地了解结节性硬化症癫痫发病机制所需的部分信息

分子/遗传

结节如何/在哪里形成以及来自什么细胞类型？

是什么改变了结节的生活史？

所有结节在分子和细胞组成方面都相同吗？

二次打击现象的本质是什么？会不会有超过一秒的命中，如何预防？

结节是动态病变吗？

生理

结节、外周皮层或两者都会产生癫痫样放电吗？

所有结节在生理特征和兴奋机制方面是否相同？

• 对结节内部和周围癫痫样放电的起始和传播的术中研究；使用电生理学和微透析

• 研究切片或培养系统中的离体组织，与分子特征相关联

• 动物模型的进一步开发

形态学

结节、SEN、SEGA 之间的相互关系是什么？

结节中的所有细胞类型是什么，它们的特征是什么，它们是如何发育的以及来自什么祖细胞？

 

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