【佳学基因检测】如何在实体瘤的基因检测中使用荧光原位杂交技术？

荧光原位杂交是 20 世纪 80 年代开发的一种细胞遗传学分子技术。 对福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织进行 FISH 的标准方案首先由病理学家选择具有代表性的肿瘤细胞群，在苏木精和伊红 (H&E) 染色的组织病理学上标记用于 FISH 分析的切片组织样本。 此预分析步骤的一个关键问题是样品中肿瘤细胞的百分比，因为百分比过低可能会导致 FISH 评分结果无信息，并且需要从选择新的 FFPE 切片开始重复整个过程 。 在接下来的步骤中，未染色的切片组织学样品经历脱蜡和再水合的标准程序，包括在预热至 60°C 的柜中加热载玻片，并将载玻片浸入一系列含有二甲苯和无水乙醇的孔中。 随后，与预处理溶液一起孵育，然后使用蛋白酶溶液进行消化。 每个 FISH 探针方案的孵育时间均经过单独优化。 该程序能够去除之前使用的化学物质，为维持细胞完整性和 DNA 结构提供最佳条件。 失去交联的核酸可以很容易地与探针的互补序列结合，显着提高杂交效率。 一些方案需要使用盐酸 (HCl) 并在盐水柠檬酸钠 (SSC) 中进行额外清洗。 FISH 方案包括以下步骤：将样品和探针的细胞 DNA 变性为单链，并将探针与目标核酸序列杂交。 快速工作的杂交缓冲液显着缩短了这一步骤，从过夜孵育缩短到几个小时。 该程序的最后步骤是在富含非离子去污剂 (NP-40) 的 SSC 溶液中进行杂交后洗涤，这会减少未结合探针的非特异性信号。 FISH 载玻片的最终分析涉及使用配备一组经过调整的滤光片的落射荧光显微镜进行检测。

FISH 制备的新方法包括自动化系统，其中整个过程可以通过设备执行，例如 Ventana Medical System（图森，亚利桑那州，美国），并得到实验室技术人员的轻微支持。 这种方法可以节省时间并避免接触有害化学物质，例如手动程序中使用的二甲苯。

FISH结果通过计数每个细胞中探针的杂交信号来获得。 每个实验室都应明确自己的计数程序，包括分析的细胞数量、第二位诊断人员对细胞重新评分的百分比、对照玻片、异常结果的截止值。 尽管计数信号大多数仍以手动方式执行，但也有自动计数系统可用。 此类软件使用编程算法来搜索具有所需形状（细胞）和荧光信号存在的物体，这些信号被识别为亮点，然后进行计数。 该方法基于对诊断医生拍摄的具有肿瘤细胞的代表性区域的照片的分析。 每个字段都经过验证，包括排除非细胞对象、纠正不准确标记的细胞形状以及验证已识别的信号。 最终结果以异常细胞百分比（对于分离探针，例如基因 ALK、ROS1、EWSR1）或比率（对于 HER2/CEP17、1p/1q、19q/19p）表示。

FISH 技术的现代概念提出了专用于分析循环肿瘤细胞 (CTC) 的微流体平台。 这些细胞可以从患者的血液样本中获得，并用作诊断和转移预后的肿瘤生物标志物。 将应用于微阵列的细胞 DNA 放入微通道中，从而实现与化学品的流式孵育。 以这种方式，探针和靶序列之间的杂交过程的动力学得到改善。 这显着增强了信号强度。 此外，该方法提高了再现性并减少了劳动时间。 该方法已针对 HER2、KMT2A（赖氨酸甲基转移酶 2A）等基因进行了测试。 接收CTC的方式似乎是微流控平台的最大挑战。

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