【佳学基因检测】乳腺癌miRNA基因检测

乳腺癌miRNA基因检测导读
2018 年的癌症统计数据显示，全球女性癌症发病率为 860 万，癌症死亡人数为 420 万。此外，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其中 20% 会发生转移。这为成功治疗提供了很小的机会，因此迫切需要识别用于诊断和预后预测转移性疾病的新分子标记物以及开发创新的治疗分子。癌症中差异表达的 microRNA (miRNA) 导致肿瘤发生促进基因的表达发生多种变化，这些基因主要在乳腺癌中进行了研究。在此，乳腺癌miRNA基因检测行动小组总结了有关乳腺癌特异性 miRNA 表达谱及其参与调节侵袭过程的最新数据，与细胞骨架结构、细胞-细胞粘附连接、癌细胞-细胞外基质相互作用、肿瘤微环境、上皮-间质转化和癌细胞干细胞能力的变化有关。然后，乳腺癌miRNA基因检测行动小组专注于单个 miRNA 的表观遗传调控及其与其他调控基因的修饰相互作用，并回顾了 miRNA 异构体和外泌体介导的 miRNA 转移在癌症侵袭性中的功能。尽管对 miRNA 在癌症中的功能的研究仍在进行中，但本文的结果有助于改善转移性癌症管理。然后，乳腺癌miRNA基因检测行动小组专注于单个 miRNA 的表观遗传调控及其与其他调控基因的修饰相互作用，并回顾了 miRNA 异构体和外泌体介导的 miRNA 转移在癌症侵袭性中的功能。尽管对 miRNA 在癌症中的功能的研究仍在进行中，但本文的结果有助于改善转移性癌症管理。然后，乳腺癌miRNA基因检测行动小组专注于单个 miRNA 的表观遗传调控及其与其他调控基因的修饰相互作用，并回顾了 miRNA 异构体和外泌体介导的 miRNA 转移在癌症侵袭性中的功能。尽管对 miRNA 在癌症中的功能的研究仍在进行中，但本文的结果有助于改善转移性癌症管理。
关键词： miRNA表达，miRNA靶基因，表观遗传调控，女性癌症，乳腺癌，侵袭性，转移




1.简介
来自国际癌症研究机构的 GLOBOCAN 2018 年统计估计显示，有近 860 万新女性癌症病例和 420 万相关死亡病例。其中，乳腺癌、子宫颈癌、主要是子宫内膜癌、卵巢癌、外阴癌和阴道癌的发病率分别为 24.2%、6.6%、4.4%、3.4%、0.5% 和 0.2%，分别为 15%、7.4%、2.1% 、4.4%、0.4% 和 0.2% 的死亡率，分别为 。这些肿瘤的统计和扩散的比较显示如下。
虽然近五分之一的乳腺癌患者 (BC) 发展为转移性疾病，但在初步诊断时，约 6% 的患者在骨、肝、肺和非腋窝淋巴结中有远处转移，而在脑中则较少。相比之下，13% 的宫颈癌患者 (CC) 被归类为晚期，他们通过血液和淋巴系统的转移具有不同的治疗和存活率。CC 可以扩散到腹膜淋巴结和远处器官，如肺、肝、骨和脑 。卵巢癌 (OC) 的死亡率在所有妇科恶性肿瘤中位居第二，大约 75% 的患者在诊断时腹膜腔内有癌细胞播散 。这些肿瘤大多是上皮性的，通常是原发性的，但 10-20% 被诊断为乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌或阑尾癌的卵巢转移 。最后，子宫内膜癌 (EC) 经常在恶性变化仍局限于子宫的早期被诊断出来，而无转移患者的 5 年总生存率在 74% 至 91% 之间，因为子宫内膜癌的患病率很高。侵袭性子宫内膜样型 。非子宫内膜样恶性肿瘤往往有早期转移扩散，进入子宫颈、阴道和子宫肌层，并且通常在肺部发现远处转移。与 OC 类似，罕见的 EC 已被确定为源自乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和结肠直肠癌和黑色素瘤的子宫内膜转移瘤 。转移性疾病成为一个非常严重的医学问题，因为转移通常对常规治疗有抵抗力，并且只有姑息治疗选择仍然可用。
转移发展也称为侵袭-转移级联，它涉及在不同步骤中定义的复杂过程。癌细胞通过周围的细胞外基质和基质细胞层局部渗入并进入相邻淋巴和血管的腔，在那里它们存活并通过循环系统运输，从而逃避物理损伤和宿主免疫反应。然后癌细胞被逮捕或粘附在血管壁上并渗出到远处器官的实质中，在那里存活的癌细胞形成微转移并增殖成大转移以形成转移性定植 。在这些过程中，肿瘤微环境 (TM) 中的癌细胞和非恶性细胞会发生遗传和表观遗传变化 。
转移似乎非常低效，因为体循环中不到 0.01% 的癌细胞最终会发展为肉眼可见的转移 。对癌症和非恶性细胞的分子特征和相互作用的了解越来越多，支持从原发性肿瘤中早期传播半有能力的转移性癌细胞，在远处身体部位积累各种分子变化，而不是晚期传播完全恶性细胞。这些播散的癌细胞也可以保持休眠数月和数年，然后导致以后的癌症复发。尽管增殖休眠癌细胞的启动仍不清楚，但它可能受到癌细胞与微环境成分、血液供应限制或主动免疫系统的相互作用的调节 。
对于患有早期癌症病变的患者，了解允许癌细胞从原发肿瘤物理重新定位的机制可能有助于预防转移，对于转移性播种的患者，应该更多地了解导致癌细胞成功定植的机制有助于开发更有效的治疗方法 。



2. MicroRNA 生物发生
二十年前发现了一种由大约 22 个核苷酸长的非编码 RNA 分子介导的新机制，称为 microRNA (miRNA)，它是基因表达的表观遗传调控的基础。大多数 miRNA 在不同的哺乳动物物种中高度保守，能够以序列特异性方式调节关键的生物学过程，包括分化、发育和细胞增殖 。最新的 9/2017 mirtarbase 更新确认了 2599 个人类 miRNA 分子和 15,064 个靶基因 ( http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/statistics.php )。在 380,639 个 miRNA-靶标相互作用中，5831、7676、12,886 和 359,298 个已分别通过蛋白质印迹、荧光素酶测定、微阵列和下一代测序进行实验验证 。
虽然 2016 年 6 月更新的人类癌症中差异表达 miRNA 数据库的 2.0 版记录了所有女性恶性肿瘤中上调和下调 miRNA 的数量最多，但在 BC 中发现的数量高于任何妇科癌症（http://www .picb.ac.cn/dbDEMC/statistics.html ) ，更详细的 02/2009 更新的癌症特异性 miRNA 数据库确定了 507、188、66 和 202 个 BC、CC、EC 和OC（http://mircancer.ecu.edu）。随着这项研究的建立，乳腺癌miRNA基因检测行动小组在此关注与乳腺恶性转化中特定侵袭过程相关的异常 miRNA 表达谱的当前知识。miRNA 序列经常位于内含子中，很少出现在外显子中，它们可以与宿主基因共享一个启动子，或者它们可以有一个独立的启动子，并且当位于基因间区域时，它们可以被独立地转录调节。此外，miRNA 被组织为单个单元或串联在双或多顺反子簇中，它们存在于除 Y 之外的所有人类染色体中 。大多数在细胞核中由 RNA 聚合酶 II 转录为数百个核苷酸长的初级 miRNA 转录物 (pri-miRNA)，其中包含一个 5' 主帽和一个 3' 聚 (A) 尾 。该前体在微处理过程中被 drosha 核糖核酸酶 III (DROSHA) 及其辅因子双链 RNA 结合蛋白 DiGeorge 综合征关键区域 8 (DGCR8) 微处理器复合亚基切割。这导致 60-70 个核苷酸长的前体 miRNA（pre-miRNA）具有发夹环结构 。然后通过 exportin-5 (XPO5)/Ran 鸟苷三磷酸 (GTP) 转运蛋白将前 miRNA 从细胞核主动输出到细胞质 ，然后 pre-miRNA 在末端环附近被核糖核酸酶 III DICER1 与反式激活反应性 RNA 结合蛋白（TRBP，TARBP2）或干扰素诱导的蛋白激酶蛋白激活剂（PACT，PRKRA）复合。这提供了大约 22 个核苷酸长的 miRNA 双链体 。在 5' 端配对不稳定的 miRNA 链通常代表引导链，而配对稳定的过客链通常会被降解 。成熟的指导 miRNA 链与核糖核酸酶 argonaute 2 (AGO2) 结合，miRNA 诱导的沉默复合物 (miRISC) 通过 2-8 个核苷酸长序列中的 miRNA 互补性与 mRNA 靶标的 3' UTR 结合。由于空间位阻，近乎完美的配对导致 mRNA 降解，部分互补通过 mRNA 去除或翻译障碍导致表达降低，因为 RNA 聚合酶的起始位点被阻断 。然而，一些已发表的研究表明，miRNA 与靶 mRNA 中其他区域的结合有助于维持 mRNA 翻译。这种间接机制是通过 miRNA 与 3' UTR 区域中富含 AU 的元件的相互作用或通过调节核糖核蛋白的结合序列介导的，这两者都位于靶 mRNA 中。这些相互作用导致抑制蛋白复合物的募集，这些复合物从翻译抑制中释放 mRNA 。进一步的研究表明，通过将特定 miRNA 直接结合到人胎肾和 Wilms 肿瘤中靶 mRNA 的 5' UTR 来启动转录 。另一项研究表明，miRNA 也可以靶向启动子序列，这会导致基因表达起始 。此外，下一代测序 (NSG) 技术能够检测到许多源自 miRNA 基因座的 miRNA 异构体 (isomiRNA)。isomiRNAs 可以通过在前 miRNA 加工和转录后修饰过程中的不完全切割产生，这些修饰会影响 miRNA 稳定性、亚细胞定位和靶点选择。这些生理学 isomiRNAs 通过调节目标识别在 miRNA 生物发生中也具有多种功能。
单个 miRNA 通常可以影响许多 mRNA 靶标的表达并同时调节各种生物过程。从转录到成熟 miRNA 产生的健康细胞中 miRNA 生物发生的每一步都控制着许多调节因子。这在动物细胞中得到了很好的证明。这些控制机制的破坏和 miRNA 库中的不平衡与许多人类疾病有关 。



3. MicroRNA 在癌症中的功能
与健康细胞相比，人类癌症中的 miRNA 表达差异，并且 miRNA 表达与癌症发展之间的关联首先在慢性淋巴细胞性白血病中得到描述。这些患者的染色体 13q14 区域和 miR-15a/16a 簇经常被删除，因此表明这些 miRNA 可能是肿瘤抑制因子 。
癌症相关的 miRNA 通常分为两类。第一类中的致癌 miRNAs（oncomiRs）通常是高表达的。它们有助于肿瘤进展并且对维持肿瘤表型很重要。第二类包含肿瘤抑制性 miRNA (miRsupps)，它们通过调节细胞生长、细胞凋亡、免疫细胞发育和其他癌症相关事件来抑制肿瘤发生，这些在各种癌症中经常被下调。一些与癌症相关的 miRNA 也被称为环境依赖性 miRNA，因为它们可以以组织特异性方式起作用，因此单个 miRNA 在不同癌症中可以具有致癌或肿瘤抑制作用。几位作者描述的具有双重功能的 miRNA 的例子包括 miR-17（在 BC 中具有肿瘤抑制作用，在 B 细胞淋巴瘤中具有致癌性）。最近的研究还表明，miRNA 在癌细胞转移扩散中具有关键作用。这些包括入侵和迁移与微环境的关联以及不良预后表型的发展。这些 miRNA 被称为 metastamiRs，它们在不同的肿瘤中都被上调和下调，包括 BC 。虽然较早的研究表明，与正常组织 miRNA 相比，多种人类癌症中的 miRNA 表达谱表现出 miRNA 库的全局下调，但不同的肿瘤类型具有不同的 miRNA 表达谱，可用于区分癌症类型或低分化的组织起源肿瘤 。
人类 oncomiRs 和 miRsupps 的第一次大规模生物信息学分析确定了不同的功能模式、进化速率、基因表达、染色体分布、分子大小、自由能、转录因子和靶标。这表明在人类癌症中，oncomiRs 比 miRsupps 更频繁地切割靶 mRNA。此外，与更常位于缺失染色体区域的 miRsupp 序列不同，oncomiR 编码序列主要存在于扩增的染色体区域中 。虽然这些“先驱”结果支持癌症患者中的 oncomiRs 通常上调和 miRsupps 缺失或下调的证据，但在 BC 进展期间，患者血浆样本中几种传统 oncomiRs 的表达下降。这些数据表明，个体 miRNA 的致癌或肿瘤抑制特征不能被严格定义。分子方法学的当前进展已导致 miRNA 微阵列和 NSG 在识别 miRNA 系列中的应用，从而更准确地区分不同的细胞类型，包括癌细胞。此外，许多癌症相关 miRNA 同种型的检测证实这些 isomiRNA 在 miRNA-mRNA 调控网络中很重要，并且改变的 isomiRNA 表达谱有助于癌症发展。



4. 癌症中 microRNA 生物发生的不稳定
人类癌症中 miRNA 表达水平的许多变化是由 miRNA 生物发生的失调驱动的，而 miRNA 池失衡是由于 miRNA 加工机械组件的上调或下调。主要 DROSHA、DGCR8 和 DICER1 成分的编码基因在许多实体瘤中经常上调，这会改变整体 miRNA 表达谱并有助于癌症进展的主要属性，例如增加细胞增殖、迁移和侵袭 。研究还表明，DROSHA和DICER1许多不同肿瘤中的基因下调和随之而来的蛋白质表达导致 miRNA 水平降低，并且在临床上与侵袭、转移和患者生存率差有关。
miRNA 生物发生的损害受 miRNA 调节因子的遗传和表观遗传改变的影响。在 Wilms 肿瘤（儿童肾癌）中发现了DROSHA、DGCR8、XPO5和DICER1基因中不同的体细胞和种系突变。在胸膜肺母细胞瘤（儿童肺肿瘤）和非上皮 OC 中发现了进一步的DICER1突变。此外，杂合XPO5在具有微卫星不稳定性的子宫内膜、结肠和胃肿瘤中发现了导致前 miRNA 从细胞核向细胞质输出受损的失活突变 。最近一项荟萃分析的结果还确定了两个DROSHA多态性和一个DGCR8多态性，在喉癌和 BC 的人类肿瘤发生中具有重要作用 。在 BC 患者中，已观察到 15% 至 75.5% 的DROSHA和/或DICER1的 mRNA 表达降低，这些水平与高级别肿瘤和高 Ki-67 诱导的细胞增殖指数显着相关 。其他报告表明，DICER1 mRNA 水平降低与激素受体状态和管腔 A 亚型显着相关，并且这种降低主要在转移性疾病患者中出现 。另一项研究表明，在导管原位癌 (DCIS) 的发展过程中，乳腺组织中DICER1蛋白的表达逐渐丧失，并且在转移性恶性细胞中发现了最显着的减少。这种 DICER1 蛋白的缺失在无病生存期降低的患者和以更高级别和激素受体和 BRCA1 DNA 修复相关 (BRCA1) 蛋白表达缺失为特征的更具侵袭性的肿瘤中特别观察到 。虽然减少与正常相邻组织相比，在三阴性 BC (TNBC) 中发现DICER1 mRNA 表达和增加的DROSHA水平，淋巴结转移 (LNM) 和原发性肿瘤之间的DROSHA表达没有差异，但DICER1表达显着增加 。DROSHA上调和DICER1下调的组合可以启动初级 miRNA 转录物的积累和 miRNA 不完全成熟，这些都可能导致癌症进展。
虽然在乳腺肿瘤中未发现参与 miRNA 调节的两种关键 DROSHA 和 DICER1 酶的编码基因发生致病突变或表观遗传变化，但在一组中国和非洲妇女，这些与 BC 风险显着相关 。此外，在一项 BC 病例对照研究中，在血液 DNA 样本中检测到XPO5基因中的一个错义多态性和高或高/中甲基化指数，这些分别与 BC 风险的增加和降低有关。。
三个额外的多态性已经定位在 14 个在 miRNA 生物发生中起作用的基因中。这些位于与 BC 风险相关的AGO1、AGO2和DEAD-box helicase 5 ( p68, DDX5 ) 基因中 。这进一步表明调节 miRNA 生物发生的基因中的遗传变异在评估 BC 发展风险方面可能非常有用。此外，靶向DICER1的两个 miR-103/107 和 miR-191/425 簇基因影响 BC miRNA 加工失调，其上调促进 BC 肿瘤细胞生长、侵袭和转移。最后，进一步确定 miR-103/107 通过下调 miR-200 促进上皮间质转化 (EMT) 。



5. 侵袭性乳腺癌中的 MicroRNA 失调
BC 细胞扩散到次级器官所需的关键过程是癌细胞侵袭，这可以通过已确定的细胞相互作用机制来介导，例如 EMT、集体侵袭和巨噬细胞-癌细胞反馈回路。这些涉及肿瘤细胞和基质细胞亚群之间的多重相互作用，并通过可溶性因子信号传导、直接细胞-细胞粘附和细胞外基质 (ECM) 重塑  进行。
侵袭性癌细胞 (BCSCs) 的特定乳腺癌干细胞异质亚群现已得到表征，它们被证明能够自我更新、分化、肿瘤发生和化学抗性，这对于 BC 进展、癌症复发、转移和预后不良 。与正常细胞相比，由于包括异常 miRNA 生物发生在内的多种机制，它们引发了与侵袭相关途径有关的基因表达的多重变化。
5.1 MicroRNAs 和细胞粘附
细胞-细胞和细胞-ECM 粘附维持对于正常细胞和生物体的稳态至关重要，这是通过细胞骨架调节蛋白、细胞-细胞粘附分子和 ECM 蛋白的多种活性来确保的 。粘附相关分子的失调，经常受到异常表达的 miRNA 的影响，使癌细胞脱离和转移扩散 。
5.1.1。MicroRNAs 和细胞骨架结构 高度动态细胞骨架中的肌动蛋白聚合和解聚导致细胞行为发生显着变化，这取决于当前活跃的细胞功能。这些过程由小 GTP 酶的 Ras 同源物 (Rho) 超家族调控 。已在 BC 细胞中鉴定出几种靶向 Rho 超家族成员的 miRNA。例如，miR-155直接抑制RhoA蛋白的表达，而miR-10b的表达是由Twist家族的碱性螺旋-环-螺旋转录因子（TWIST）通过靶向抑制同源框D10来间接启动入侵的。 HoxD10) 和前转移RhoC基因的上调。另一个 Rho 超家族成员，小 GTPase 细胞分裂周期 42 (CDC42)，连同 CXC 基序趋化因子受体 4 (CXCR4)，在其靶向 miR-224 下调后促进细胞侵袭。致癌基因p-21 激活激酶 1 ( PAK1 ) 编码丝氨酸/苏氨酸 p21 激活激酶 PAK1，这是一种在细胞骨架重组过程中与 RhoGTPases 相关的关键效应物。此外，PAK1 编码基因已被确定为 miR-494 的直接靶标，并且由于 miR-494 下调，BC 样本中 PAK1 蛋白高表达。这可能有助于在 BC 细胞系中观察到的克隆形成活性、迁移和侵袭 。此外，细胞骨架蛋白原肌球蛋白 1 (TPM1) 编码的基因是公认的肿瘤抑制基因。这是由 miR-21 直接调节的。miR-661 通过靶向两种蛋白质的编码基因导致紧密连接不稳定。第一个蛋白质，nectin 细胞粘附分子-1 (Nectin-1)，调节细胞-细胞连接和细胞骨架组织，而第二个磷脂转移酶 STAR 相关脂质转移结构域蛋白在上皮细胞极性中包含 10 个 (STARD10) 功能。此外，在 SNAI1 诱导的 EMT 细胞中 miR-661 的上调通过抑制上皮标志物来实现细胞侵袭。在 BC 样本中，STARD10的表达基因与 luminal 亚型的标志物高度相关，但已报道其丢失与 EMT 相关、基底样亚型的标志物之间存在负相关 。
连接蛋白 43 (CX43) 粘附分子介导细胞内通讯 ，还影响细胞骨架修饰和细胞迁移，发现这受 miR-200a 和 miR-206 的调节。两项研究还报道，降低的 miR-200a 或 miR-206 水平以及增加的CX43 mRNA 和蛋白质水平与细胞增殖、迁移和侵袭能力有关。此外，与原发性肿瘤相比，在 BC 离散的肺和联合肺和肝转移中发现更高的 mRNA CX43表达水平 。Wiskott-Aldrich 综合征蛋白家族成员 3 (WAVE3, WASF3) 蛋白是 WAVE 肌动蛋白细胞骨架重塑家族的成员，在 BC 中高度表达，尤其是在晚期。当 miR-200 簇和 miR-31 靶向WAVE3基因表达时，BC 细胞系中这些 miRNA 的水平下降，并且肿瘤组织表现出细胞骨架改变，这导致了侵袭性表型 。除了这种修饰作用，WAVE3 在核因子 kappa B (NF-κB) 信号传导中具有新的功能，因为它有助于 ECM 降解和侵袭伪足生长调节 。
跨膜细胞-细胞连接蛋白连接粘附分子-A (JAM-A) 通过与肌动蛋白结合蛋白 facsin 的结合参与紧密连接并影响细胞骨架结构 。在几个 BC 系中，miR-145 过表达导致JAM-A基因靶向的丧失导致细胞运动性和侵袭性降低 。虽然 BC 中 miR-145 表达的下调支持了这些结果，并且可以使JAM-A基因充分表达以增加癌细胞的运动性 ，但在通过上调的 miR -A 抑制 JAM-A后观察到对比活跃的 BC 细胞迁移。495 。
5.1.2. MicroRNAs 和细胞-细胞粘附连接 细胞-细胞粘附连接是组织完整性的主要保护者，细胞-细胞粘附受体能够启动许多信号转导通路 。在钙粘蛋白超家族中，由钙粘蛋白1（CDH1 ）基因编码的跨膜糖蛋白E-钙粘蛋白在相邻上皮细胞之间产生基本的粘附连接，其胞质尾部与许多细胞内蛋白相互作用，介导E-钙粘蛋白与细胞间的结合。肌动蛋白细胞骨架 。在包括 BC 在内的许多上皮癌中，E-cadherin 失活被认为是侵袭-转移级联反应中的关键事件，并且 E-cadherin 免疫染色已被证明可用于在不确定的组织学结果中区分乳腺小叶病变和导管病变 。
除了受到几个CDH1体细胞突变和杂合性丧失（主要在侵袭性小叶 BC 中）和启动子甲基化 的影响之外，发现CDH1基因直接被 miR-9 抑制。这种 miRNA 的上调与侵袭性和转移状态有关 。虽然与正常组织相比，在良性肿瘤中发现了降低的 miR-9 水平，但在恶性与良性肿瘤中却有所增加，但不等于在正常组织中表达的水平。这些结果证明了 miR-9 的动态变化及其在肿瘤进展过程中的多种不同功能 。此外，CDH1沉默通过靶向有助于癌细胞 EMT 的几种重要转录因子间接调节其他 miRNA。这种关系在随后的第 5.3 节中进行了回顾。
含有 CUB 结构域的蛋白 1 (CDCP1) 跨膜糖蛋白已在 BC 细胞系中被定义为细胞粘附和运动的调节剂 。这种蛋白质有助于破坏粘附连接，并发现在人类上皮癌中广泛表达，并与晚期和患者存活率低有关。CDCP1基因表达增加可能是靶向 miR-198 下调的结果 。
5.1.3. MicroRNAs 和细胞-ECM 相互作用 细胞-ECM 相互作用的减弱是癌细胞脱离的进一步先决条件。存在于癌细胞表面的 ECM 蛋白的主要受体，整合素 α/β 异二聚体，介导跨细胞膜的双向信号传导。这能够调节许多细胞过程，例如细胞增殖、分化、存活、粘附、运动和整合素失调，从而促进癌症的侵袭和转移 。通过靶向 β1（α2、α5 和 αV）和 β3 整合素的几个 α 亚基伙伴，miR-31 似乎是整合素的关键调节因子 。此外，一些研究已经调查了 miRNA 对单个整合素的调节。减少整合素α2 ( ITGA2) BC 细胞中的 mRNA 是由与细胞间相互作用的降解、F-肌动蛋白纤维的解聚和细胞迁移整合相关的 miR-373 靶向引起的。此外，与邻近的非恶性组织相比，在 BC 中发现 ITGA2 蛋白水平显着降低和 miR-373 表达增加，主要在 LNM 患者中。相比之下，进一步的体外研究表明，miR-142-3p 的过表达影响了几种细胞骨架结构和细胞运动基因，包括Wiskott-Aldrich 综合征样( WASL ) 和抑制 BC 细胞侵袭性的ITGAV 。此外，β1 家族整合素之一 (α3β1) 通过激活 Rac1/PAK1 通路信号传导、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、c-Jun NH2-末端激酶 (JNK) 和 PAK1  间接影响 BC 侵袭。
两种激酶，PAK1 和粘着斑激酶 (FAK)，被证明是 HoXD10 依赖性 miR-7 直接靶向的，并且这种 miRNA、PAK1 和 FAK 蛋白上调的联合下调与更具侵袭性的表型相关. 在转移性 BC 患者中也观察到 miR-7 的更明显下降 。此外，通过靶向信号转导和转录激活因子 5A ( STAT5A )、去整合素和金属蛋白酶结构域 17 ( ADAM17 ) 和整合素 β4 (ITGB4)基因，miR221/222 被证明是 BC 细胞增殖和侵袭的主要调节因子；ITGB4编码与层粘连蛋白受体相互作用的粘附分子。虽然作者没有证实 miR-221/222 和ITGB4表达之间的负相关，但在低分化 G3 肿瘤患者中观察到 ITGB4 蛋白表达和 miR-221/222 下调在腔 BC 中 。
ADAM 多结构域蛋白具有两个主要的去整合素和金属蛋白酶结构域，参与蛋白水解和细胞粘附，主要位于细胞膜上。蛋白水解活性 ADAM 通过脱落可变底物（如粘附配体、生长因子及其受体和各种细胞因子）在 ECM 重塑中发挥作用。ADAM 中的表达变化，主要在 ADAM9、10、12、15 和 17 中，与癌症进展相关 。在那里，发现 ADAM9 编码基因的转录被 miR-33a、miR-126 和 miR-154 靶向。与正常乳腺组织相比，这些 miRNA 抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并且从早期到非转移性和 LNM 阳性 BCs 观察到它们在肿瘤发生中的水平逐渐降低。
相比之下，ADAM8 调节几种 miRNA，包括 miR-720。这种蛋白质的去整合素和富含半胱氨酸的结构域通过细胞外信号调节激酶 (ERK) 信号级联激活 miR-720 表达，从而在 TNBC 细胞中诱导侵袭性表型。此外，在 ADAM8 高表达的 TNBC 患者的血清中存在增加的 miR-720 水平 。没有金属蛋白酶结构域的 ADAM 蛋白在蛋白水解上是无活性的，但它们通过它们的去整合素结构域与整合素相互作用。这会影响细胞粘附 ，并且这些蛋白质的变化会导致癌症侵袭。例如，ADAM23被认为是一种肿瘤抑制因子，它在 BC 患者中因启动子甲基化而在表观遗传上失活。尚未发现调节其编码基因的 miRNA；然而，乳腺癌miRNA基因检测行动小组之前发表过ADAM23最有可能参与间充质循环肿瘤细胞的扩散 。
5.2. MicroRNAs 和肿瘤微环境
许多研究表明，由不同类型的基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和免疫细胞）以及 ECM 成分组成的微环境变化在癌症进展中具有重要作用 。异常表达的基质 miRNA 可以调节 TM  内的细胞间串扰。癌症相关成纤维细胞 (CAF) 产生许多在侵袭和转移中具有重要功能的细胞因子和趋化因子。此外，最近报道了成纤维细胞衍生的 CXC 基序趋化因子配体 12（CXCL12，SDF1）和内皮细胞之间的相互作用通过增加血管通透性来增强肿瘤细胞的血管内渗透 。CXCL12 _miR-126 和 miR-126* 直接靶向该基因，导致癌细胞以 CXCL12 依赖性方式产生的 CC 基序趋化因子配体 2 (CCl2) 受到抑制。作者记录了 miR-126 和 miR-126* 可以修饰 TM，并且他们通过 miR-126 和 miR-126* 依赖性抑制间充质干细胞和炎性单核细胞证明了小鼠异种移植模型中 BC 转移的抑制作用在肿瘤基质环境中招募 。基质成纤维细胞产生的趋化因子 CXCL12 主要与癌细胞表面高表达的 CXCR4 受体结合，从而诱导细胞内信号传导，从而导致肿瘤进展、血管生成、转移和存活 。另一项研究报告称，miR-494 单独显着抑制 CXCR4 蛋白，并且在 BC 细胞中下调。这种 miRNA 还通过 CXCR4 依赖性 Wnt/β-catenin 信号通路抑制 BC 的发展 。
此外，在动物模型和 BC 患者样本中均检测到 miR-320 作为基质成纤维细胞中磷酸酶和张力蛋白同源物( PTEN ) 基因的下游调节剂。PTEN基因影响乳腺组织中邻近内皮细胞和上皮细胞的mRNA 表达谱。此外，BC 中的 miR-320 下调及其直接ETS 原癌基因 2 ( ETS2 ) 靶标的上调对于 PTEN 的丢失至关重要，而PTEN通过微环境修饰促进肿瘤侵袭性和血管生成 。进一步的作者发现，基质 miR-200 簇成员（miR-200a、miR-200b、miR-200c 和 miR-141）直接介导正常成纤维细胞重新编程为 CAF。这些 miRNA 的下调使其靶基因朋友白血病整合 1 ( FLI1 ) 和转录因子 12 ( TCF12 ) 高表达，这些基因在细胞的发育和分化中起作用，并导致 ECM 重塑和 BC 细胞侵袭和转移。
除了基质细胞蛋白外，异常表达的 miRNA 还调节基本 ECM 蛋白的表达，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。据观察，这些在几种类型的癌症中充当整合素胞外结构域的配体 。TNBC 中层粘连蛋白亚基 alpha 4 ( LAMA4 ) mRNA 和蛋白质表达的上调以及 miR-539 靶向性的降低也已确定 。最后，转移抑制与靶向 ECM 成分生腱蛋白 C 编码基因 ( TNC ) 的 miR-335 表达之间存在关联。) 通过检查其他结构 ECM 蛋白（包括糖胺聚糖、蛋白聚糖和基质细胞蛋白）观察到 ，并且在预后不良的 BC 患者中检测到 miR-335 的丢失 。
此外，几种 ECM 重塑酶直接影响 ECM 功能和促进癌细胞从原发性肿瘤分离的生物力学特性。基质金属蛋白酶的高表达诱导了基底膜中的胶原蛋白水解 。其中，位于 BC 细胞表面的基质金属肽酶 14 (MMP14) 被证明在集体迁移中具有活性 ，并且 MMP14 的上调和 miR- 靶向的下调181a-5p 在乳腺肿瘤的侵袭性前沿比在相邻的正常组织中更明显 。另一方面，主要在 LNM 患者中发现的 miR-21 上调与金属蛋白酶组织抑制剂 3 (TIMP3) 蛋白的减少相关，促进了 ECM 降解和癌细胞侵袭 。
发现额外的尿激酶纤溶酶原激活剂 (uPA) 酶可催化纤溶酶原转化为活性纤溶酶，从而通过激活几种 pro-MMPs 来启动 ECM 和基底膜解体 。转移性 BC 中 uPA 表达的上调以及 miR-193b 和 uPA 蛋白表达之间的负相关反映了这种 miRNA 在 BC 侵袭性中的作用 。然而，在高表达 uPA 与 DROSHA 和 DGCR8 表达降低相关的 BC 细胞中发现了较低水平的成熟 miR-193a、miR-193b 和 miR-181a，但不是它们的主要靶向 miRNA 转录物，这说明了uPA 上调时 miRNA 生物发生受损 。
转录因子 gata 结合蛋白 3 (GATA3) 通过其调节 miR-29b 表达在微环境重塑和转移抑制中具有相当复杂的功能，并导致表达 GATA3 的管腔乳腺癌中 miR-29b 的下调在癌细胞的转移发展和间充质表型中。作者提出 miR-29b 通过靶向参与血管生成、胶原重塑和蛋白水解的几种促转移调节基因来抑制转移，例如血管内皮生长因子 A ( VEGFA )、血管生成素样 4 ( ANGPTL4 )、血小板衍生的生长因子( PDGF )、赖氨酰氧化酶 (LOX)和MMP9，并通过靶向ITGA6、ITGB1和转化生长因子 β (TGF-β)，影响分化和上皮可塑性 。
5.3. 上皮间质转化中的微小 RNA
EMT 和逆过程，间充质-上皮转化 (MET)，在许多生理过程中都很活跃，包括胚胎植入、胚胎发生和器官发育。在病理条件下，这些机制参与组织再生、器官纤维化、癌症进展和转移发展。在 EMT 过程中，上皮癌细胞失去极性、细胞-细胞接触和细胞-基底膜相互作用，并获得间充质细胞表型，其特点是迁移能力增强、侵袭性和对细胞凋亡的抵抗力增加 。EMT 程序由许多细胞外信号和转录因子启动，包括 TGF-β、Notch 受体和 Wnt/β-连环蛋白信号通路以及结合酪氨酸激酶受体的生长因子，这些都经常以顺序方式起作用 。多功能细胞因子 TGF-β 是 EMT 的有效诱导剂，在 BC 患者的血浆和肿瘤浸润前沿发现 TGF-β 水平升高，这些与 LNM 的存在相关 。最近，描述了 TGF-β1 诱导的 EMT 的机制，并显示其促进趋化性介导的 BC 细胞通过淋巴管的迁移 。其他作者发现 miR-10b 和 miR-23a 直接受 TGF-β1 调节，这两种 miRNA 的上调表达与侵袭性 BC 相关。此外，miR-23a 直接靶向并抑制CDH1基因，从而激活 Wnt/β-catenin 信号传导。这些结果表明 miR-10b 和 miR-23a 都有助于 TGF-β1 诱导的 EMT 和 BC 细胞和患者组织中的肿瘤转移 。此外，过度活化的 Wnt/β-连环蛋白信号被证明可以驱动 EMT 和转移性 BC 细胞的转移。在这些细胞中，观察到 miR-374a 的异位过表达以及同时抑制其直接靶标WNT 抑制因子 1 ( WIF1 )，PTEN和WNT 家族成员 5A (WNT5A)，它们都是 Wnt/β-catenin 信号传导的负调节因子。在有远处转移的 BC 患者中观察到显着上调的 miR-374a 水平与较差的无转移生存期相关 。
EMT 诱导的标志是通过抑制由CDH1基因编码的主要细胞 - 细胞粘附分子 E-钙粘蛋白而丧失粘附连接。显示了转录因子蜗牛家族转录抑制因子 1 (SNAIL1)、SNAIL2/SLUG、锌指 E 盒结合同源框 1 (ZEB1)、ZEB2 和 TWIST1（由SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2和TWIST1基因编码）成为 EMT 过程的重要诱导剂。这些通过与CDH1基因启动子区域中的 E-box 元件结合来抑制 E-cadherin 表达。然而，单独的 E-cadherin 和 EMT 诱导剂均受几种 miRNA 的调节。
与 EMT 调节有关的一个经过充分研究的簇是 miR-200。这有五个成员分为两个独立的转录单元，其中 miR-200b、miR-200a 和 miR-429 聚集在 1 号染色体的基因间区域，而 miR-200c 和 miR-141 位于 12 号染色体的内含子中一种非编码 RNA 。在 70 个 TNBC 乳腺肿瘤中，其他作者发现，与雌激素受体阳性 (ER+) 肿瘤患者相比，以化生性癌为主的人类表皮生长因子受体 2 阳性 (HER2+) 患者的 miR-200 簇表达降低。在化生 BC 和自发 EMT 的体外模型中观察到所有五个 miR-200 簇成员的表达降低。这与 EMT 转录诱导物SNAI1、SNAI2、ZEB1和ZEB2基因的表达增加以及 miR-200c/141 基因座的高甲基化相结合 。
几项研究调查了单个 miR-200 簇成员在 EMT 中的作用。在那里，Kindlin 家族蛋白以前被定义为整合素功能的调节剂。它们表现出不同的表达谱并参与了许多生物过程，包括细胞粘附和迁移 。Kindlin-2 的表达与人和小鼠 BC 细胞中的 BC 转移表型相关，miR-200b 直接靶向和灭活其编码基因，fermitin 家族成员 2 ( FERMT2 )，导致 EMT 和转移。在进一步的研究中，通过 miR-200b/429 介导的ZEB1下调，将肿瘤蛋白 p53 结合蛋白 1（TP53BP1、53BP1）描述为 EMT 的新型负调节剂。尽管53BP1的表达与 miR-200b 和 miR-429 的表达呈正相关，而与 18 个 BC 样本中的ZEB1基因表达呈负相关，但体外实验未能显示53BP1与这两种 miRNA 之间的直接相互作用 。最近，肌动蛋白相互作用蛋白 SH3 和 PX 结构域 2A（TKS5、SH3PXD2A）和肌球蛋白轻链激酶（MYLK）被确定为 miR-200c 的新靶点。作者表明，ZEB1/miR-200c 反馈回路控制肿瘤细胞的侵袭。在 BC 细胞系和患者样本中观察到 EMT 和侵袭伪足形成的同时激活，这与ZEB1和TKS5和MYLK基因的共表达以及 miR-200c 的下调靶向有关。进一步发现 p53 通过与MIR30A启动子结合诱导 TNBC 患者中 miR-30a 的表达，该 miRNA 直接靶向ZEB2表达。此外，发现 BC 中 miR-30a 的表达降低与 p53 缺乏、LNM 和预后不良有关。这项研究提供的证据表明，肿瘤侵袭性是通过 p53/miR-30a/ZEB2 轴控制的，这可能随后影响 miR-200c 的表达 。
另一个重要的 EMT 相关簇 DLK1-DIO3 显示包含位于 14 号染色体上的七个肿瘤抑制 miRNA（miR-300、-382、-494、-495、-539、-543 和 -544）。这些 miRNA众所周知的 EMT 激活剂的靶编码基因，例如 TWIST1、ZEB1/2 和 B 淋巴瘤 Mo-MLV 插入区 1 同源物 (BMI1)，它们在具有 EMT 的 BC 细胞和侵入性导管 BC 样本中下调. 体外实验详细显示 miR-300、miR-539 和 miR-543 靶向TWIST1基因，并且 miR-300、miR-494、miR-495 和 miR-544 抑制BMI1表达。然后进一步确定 miR-494 和 miR-539 抑制ZEB1基因。此外，miR-300、miR-494、miR-539 和 miR-543 的上调与特定 miR-200 簇成员的表达增加显着相关；这可能是由于TWIST1通过与该簇的启动子区域结合而被认为是 miR-200 阻遏物的抑制所致 。
除了上述簇外，其他主要的 EMT 诱导剂还受其他 miRNA 的调节。在包括 BC 在内的 p53 功能丧失癌细胞系中观察到 EMT 的 SNAIL1 蛋白依赖性激活，因为 miR-34 的水平降低，miR-34 是SNAI1的直接调节因子。这些结果证明了 EMT 程序中 p53、miR-34 和 SNAIL1 之间的相互作用 。其他作者观察到 miR-124 水平降低，同时在 BC 细胞系和患者中靶向SNAI2基因的表达上调。在进一步的 BC 体外研究中，观察到 miR-203 和 miR-200 簇成员表达在SNAI1期间以时间依赖性方式降低-诱导的 EMT。此外，miR-203 抑制的内源性SNAI1形成双负 miR-203/ SNAI1反馈回路，与已知的 miR200/ ZEB1反馈回路一样，这可以作为 EMT 诱导核心网络发挥作用 。在一项 miRNA 微阵列研究中，与正常组织相比，在 DCIS、侵袭性和转移性 BC 样本中发现了 21、47 和 107 种不同的 miRNA 表达谱，并且 miR-205 下调与转移表型相关 。显示 miR-205 直接靶向 ZEB1 和 ZEB2 转录因子的编码基因，这些基因启动 EMT 过程 。其他作者显示了 BC 细胞系中 SNAIL2/SLUG 转录因子和 miR-221 之间的直接关系。发现 miR-221 的表达部分依赖于 SNAIL2，细胞迁移的抑制与 SNAIL2 沉默和 miR-221 表达的维持有关 。此外，miR-221 直接靶向CDH1的开放阅读框，导致 E-钙粘蛋白抑制。在这项研究中，证实了一种新的机制，涉及 SNAIL2 促进的 miR-221 过表达对 E-钙粘蛋白的转录后抑制 。miR-221 和 miR-222 都被描述为促进基底样 BC 亚型的特异性 miRNA，它们的表达增加导致上皮基因的下调和间充质特异性基因的上调，这些基因有助于侵袭性和癌细胞迁移增加。此外，miR-221/222 通过靶向转录抑制因子 gata 结合 1 编码基因 ( TRPS1 )间接降低 E-cadherin 的表达， TRPS1直接抑制ZEB2转录 。与主要的 EMT 相关转录因子相比，对 BC 中 TWIST1 表达的 miRNA 调节的研究较少。扭曲1基因被 miR-720 靶向，该 miRNA 的下调与淋巴结转移的存在有关 。
此外，预测 miR-506 会靶向其他参与 EMT 的基因，并且在 BC 组织中观察到 miR-506 的下调 。miR-506 的过表达导致抑制 TGF-β 诱导的 EMT，并通过下调间充质基因如SNAI2、波形蛋白( VIM ) 和CD151 分子来阻止细胞粘附、侵袭和迁移(raph 血型) ( CD151 )。此外，NF-κB 通过与其上游启动子区域结合来抑制 miR-506 的转录 。发现另一种 EMT 抑制剂 miR-153 在转移性 BC 细胞系和 BC 样本中下调。正常表达的 miR-153 直接靶向metadherin (MTDH)基因，一种 EMT 的诱导剂，导致 miR-153 诱导的 BC 细胞迁移和侵袭的抑制 。此外，miR-375 靶向促进 TGF-β 信号网络激活和 EMT 诱导的身材矮小同源框 2 (SHOX2) 转录因子编码基因。作者分析了 Gene Expression Omnibus 数据库中 BC 基因表达的微阵列数据，发现 miR-375 表达的丧失和SHOX2表达的增加与 BC 患者的低生存率有关。这说明了SHOX2在 BC 进展中的作用 。
5.4. MicroRNAs 和癌症干性
BCSCs 是具有干细胞样特性的一小部分癌细胞，其发展与通过癌细胞传播成功完成侵袭-转移级联反应密切相关，并且由 EMT 诱导驱动 。BCSCs 通过释放 TGF-β 和表达特定的 miRNAs 来刺激 EMT，这些 miRNAs 靶向基因和对调节干细胞特性（如自我更新和分化）很重要的信号通路 。
自我更新和分化之间的平衡是BCSCs的一个重要特征，多个miRNA参与调节这种平衡。然而，对于人类BCSCs的干性维持至关重要的是抑制三个 miRNA miR-200、 miR -183 和let -7 簇，以及上调 miR-221。同时，下调 miR-200 簇会导致多梳阻遏复合蛋白的表达增加，例如 BMI1 和 zeste 12 同源物抑制因子 (SUZ12)，它们是已知的干细胞自我更新和多能性调节因子，并促进发育BCSCs 的上述特征。SUZ12 控制 E-cadherin 和 miR-200/SUZ12/E-cadherin 轴的表达，这对于维持 BCSC 表型和调节 BC 转移至关重要。miR-200b 的过表达通过抑制 SUZ12 来阻止 BCSC 的形成，并阻止 E-cadherin 的抑制，从而调节肿瘤的生长和侵袭性 。miR-200 簇成员与 ZEB1 和 ZEB2 等转录因子之间的相互作用也可以抑制整个 miR-200 簇  的转录，并且已显示特异性蛋白 1 (Sp1) 和 p53 结合可导致miR-200b/200a/429、miR-200c 和 miR-183 转录的激活 。
此外，miR-200 簇、miR-22 和 ZEB1/ZEB2 之间的关联在干性调节和 EMT 中具有重要作用。MiR-22 通过直接靶向甲基胞嘧啶双加氧酶的十一个十一易位 (TET) 家族的编码基因发挥其转移潜力，从而抑制 miR-200 簇启动子的去甲基化并抑制其表达。miR-22 的过表达与不良临床结果和患者 TET-miR-200 簇轴的沉默相关 。
miR let-7 调节关键的 BCSC 特征，包括自我更新、多能分化和形成肿瘤的能力，作者指出，与原发性肿瘤中的非干癌细胞相比，miR let-7 在 BCSC 中的表达降低和癌细胞系 。相反，增加的 let-7 水平导致 Harvey 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 (H-RAS) 和高迁移率组 AT-hook 2 (HMGA2) 的蛋白质表达降低，它们是已知的 let-7 目标 。这些基因编码与间充质细胞分化和肿瘤形成有关的 DNA 结合蛋白，它们与干细胞的自我更新和多能潜能有关。此外，虽然在富含 BCSC 的细胞系中 H-RAS 沉默降低了自我更新，但对分化的影响很小，但 HMGA2 沉默增强了分化但不增强自我更新 。同样，miR-30 表达的降低和随后其直接基因靶标泛素结合酶 9 ( UBC9 ) 的上调有助于维持 BCSCs 的自我更新能力。Ubc9 对于与自我更新过程相关的许多蛋白质的 sumoylation 至关重要 。
八聚体结合转录因子 4 (OCT4)、Sry 相关高迁移率框 2 (SOX2) 和同源框转录因子 (NANOG) 是主要的转录因子。这些被称为干细胞多能性的主要调节因子，负责维持胚胎干细胞 (ESC) 的未分化状态。这三个因子与它们自己的启动子以及编码另外两个因子的基因的启动子结合，这种自动调节增强了基因表达的稳定性并促进了多能状态的维持。它们还受到 ESC 特异性 miRNA 与其启动子区域结合的直接表观遗传调控  以及在ESC 生成过程中通过逐渐去除 DNA 和 H3K9 甲基化  在转录后水平 。如上所述，miR-221 的过表达有助于 BC 中的干性维持。该 miRNA 通过靶向和抑制DNMT3B基因作为 oncomiR 发挥作用，这导致几个启动子区域的 DNA 甲基化发生广泛变化，包括NANOG和OCT 3/4启动子区域。与分化细胞相比，在 BCSC 中观察到这两种干细胞多能性调节剂的水平降低 ，相反，miR-590-5p 和 miR-140 充当肿瘤抑制因子并通过靶向SOX2基因来抑制干性。这导致 BCSC 人口减少 。



6. microRNA 表达的表观遗传调控
许多基因的异常表达导致其功能低下，是肿瘤组织的典型特征。在癌症中，基因改变和表观遗传事件的积累可以诱导表达谱的变化，包括 DNA 的异常高甲基化和低甲基化以及染色质结构重新建模后组蛋白修饰的变化 。如上所述，miRNA 可以作为癌基因、肿瘤抑制因子、转移扩散的调节剂和癌细胞干性的调节剂发挥作用。癌症中 miRNA 表达的失调是遗传或通过表观遗传机制引起的，最常见的原因是启动子 miRNA 通过其自身的转录单位或 miRNA 序列所在的宿主基因的转录单位甲基化。 。
表观遗传失活在具有肿瘤抑制功能的 BC 相关 miRNA 以及介导细胞增殖和 EMT 抑制的 miRNA 中得到广泛研究 。此外，在参与前几节所述的侵入过程的几个 miRNA 基因中发现了启动子甲基化。在被认为是主要 EMT 调节因子的 miR-200 簇成员中，尽管存在 CpG 岛，但仅在转录单位 miR-200c/141 中发现 DNA 甲基化沉默，而在 miR-200b/200a/429 中未发现在两个转录起始区域 。miR-200c/141 甲基化与SNAI1、SNAI2表达增加之间的直接关联、ZEB1和ZEB2侵袭性 BC 中的靶基因反映了 miRNA 表观遗传调控在 EMT 过程中的关键作用 。
类似地，聚集在 DLK1-DIO3 区域的 7 个 miRNA（miR-300、-382、-494、-495、-539、-543 和 -544）在激活EMT 程序，主要在 TWIST1 蛋白信号网络内 。此外，先前发现 miR-203 是 EMT 相关基因SNAI1  的调节剂，并且在另一项研究中也观察到miR-203 SNAI2靶向 。此外，在转移性 BC 细胞中观察到 miR-203 的表观遗传沉默，而 miR-203 表达的丧失有助于 EMT 过程和癌症干细胞发育 。EMT 也是由于 miR-205 更复杂的表观遗传调控而启动的。染色质修饰多梳组无名指 2 (Mel-18, PCGF2) 蛋白通过抑制 DNA 甲基转移酶介导的MIR205宿主基因启动子的 DNA 甲基化来影响 miR-205 的表达。这导致通过主动转录 miR-205减少ZEB1和ZEB2基因的靶向性。另一方面，Mel-18 的缺失增加了 ZEB1和ZEB2的表达以及转移性 BC 细胞系的侵袭和迁移 。Erb-B2 受体酪氨酸激酶 2 (ErbB2) 信号通过 Ras/Raf/MEK/ERK 通路下调 miR-205 对 miR-205 表达产生相反的影响，这会影响 DNA 甲基转移酶活性，从而导致MIR205宿主基因的高甲基化。
在另一项研究中，由于作为miR-34c 靶基因的NOTCH4的表达，在具有能够自我更新、EMT 和细胞迁移的干细胞特征的乳腺肿瘤起始细胞中发现了 miR-34c 的下调。在该 miRNA 的启动子区域中鉴定出单个 CpG 位点的高甲基化，这通过降低 Sp1 DNA 结合活性导致 miR-34c 转录抑制 。如前面5.1.1和5.1.3 所述，miR-31 表达通过整合素调节与细胞骨架重塑和细胞-ECM 相互作用相关 。作者最近通过LOC554202 miR-31 宿主基因中的启动子高甲基化证明了 miR-31 失活在 BC 侵袭中的重要性。这种活性主要在基础亚型的非常侵袭性的 TNBC 细胞系中发现 。类似地，miR-126/miR-126* 被癌细胞中其EGF 样结构域多 7 ( EGFL7 ) 宿主基因的启动子甲基化下调。低水平的 miR-126/miR-126* 阻止了 TM 中的间充质干细胞和炎性单核细胞募集，从而导致 BC 转移 。
miR-335 被定义为一种转移抑制因子，尽管它在人类 BC 中经常因基因缺失而沉默，但在从几个不同 BC 患者的恶性细胞群中分离的转移衍生物中，它会因启动子高甲基化而失活。其他作者更详细地研究了新鲜冷冻的 BC 样本中三个 miR-124a 基因组位点的甲基化谱，他们确定了 DNMT3B 蛋白过表达与 miR-124a-3 高甲基化之间的相关性。miR-124a-1、miR-124a-2 和 miR-124a-3 基因座的同时甲基化与 LNM 和癌组织中的高有丝分裂评分相关 。
很大程度上表观遗传调控是由 miR-221 介导的，miR-221 可以被认为是 BC 中 DNA 甲基化的关键解除调节剂。该 miRNA 被证明直接靶向主要的从头甲基转移酶 DNMT3B 编码基因，这可能导致 DNA 甲基化谱发生广泛变化，但目前仅观察到与 BC 干性相关。
与 BC 侵袭性相关的不同类型的表观遗传事件是由组蛋白甲基化失调引起的。在 BC 细胞系中，miR-708 直接靶向重要的表观遗传调节因子赖氨酸特异性去甲基化酶 1 (LSD1) 的编码基因，该基因特异性使组蛋白 3 中的单甲基化和二甲基化赖氨酸 4 和赖氨酸 9 去甲基化。miR-708 的抑制与细胞增殖和侵袭增加，但LSD1过表达可以抵消 miR-708 的这些影响 。进一步的作者表明，转移性 BC 中的 miR-708 抑制受多梳阻遏复合物 2 (PRC2) 诱导的组蛋白 3 (H3K27) 中赖氨酸 27 的三甲基化的调节。此外，靶向 miR-708 的神经元逐渐减少（NNAT ) 基因在乳腺转移进展过程中启用了调节离子通道的神经肽的过度表达。增加的细胞内钙水平可以启动细胞迁移和转移发展 。
总之，与 BC 中特定侵袭过程和癌细胞干性相关的 miRNA 及其在表达、表观遗传调控类型、靶基因和参与侵袭-转移级联步骤方面的变化呈现在表格1. 上调和下调的 miRNA 根据参与 BC 侵袭的个体过程分为图1.

图1:在与乳腺癌侵袭性和干性相关的特定过程中上调和下调的 microRNA 表达谱。ECM，细胞外基质。注意：miR-126* 是来自相同转录本的 miR-126 的伴侣，具有相似的表达模式 。
表1:MicroRNAs 参与了乳腺癌细胞和患者肿瘤样本中的侵袭过程和癌细胞干性。

miRNA 名称	表观遗传调控	miRNA在肿瘤中的表达	目标基因	评估样品	miRNA 在侵袭-转移级联中的作用	参考
let-7		下	H-RAS、HMGA2	CL，N = 25	自我更新，干劲十足
miR-7		下	PAK1	CL，AM	细胞运动和侵袭抑制
		下	FAK	CL，N = 111	侵袭和转移抑制
miR-9		向上	CDH1	CL，AM，N = 23	细胞运动、侵袭、转移
miR-10b		向上	HOXD10	CL，AM，N = 23	细胞迁移和侵袭
miR-21		向上	TPM1	CL	肿瘤生长和恶性表型
		向上	TIMP3	CL，N = 32	侵袭和淋巴结转移
miR-22		向上	TET1-3	CL，AM，N = 108	EMT，干性
miR-23a		向上	CDH1	CL，AM，N = 30	EMT，转移
miR-29b		下	VEGFA、ANGPTL4、PDGF、LOX、MMP9	CL，AM	EMC 重塑和转移抑制
miR-30a		下	ZEB2	CL，N = 49	EMT，侵袭和远端扩散抑制（TNBC）
mirR-30		下	UBC9	CL，AM，N = 6	自我更新
miR-31		下	WAVE3	CL，N = 19	侵入性表型减少
		下	ITGA2、ITGA5、ITGAV。ITGB3	CL	侵袭和转移抑制
	DNA met	下		CL	侵袭抑制 (TNBC)
miR-33a		下	ADAM9	CL，AM，N = 23	侵袭和转移抑制
miR-34		下	SNAI1	CL	EMT抑制
miR-34c	DNA met	下	NOTCH4	CL	EMT、迁移和自我更新抑制
miR-103/107		向上	DICER1	CL，AM	EMT，细胞迁移，转移
miR-124		下	SNAI2	CL，AM，N = 38	EMT和转移抑制
miR-124a	DNA met	下		N = 60	增殖和转移抑制
miR-126		下	ADAM9	CL，N = 40	入侵抑制
miR-126/126*	DNA met	下	CXCL12	CL，AM，N = 251	转移抑制
miR-140		下	SOX2	CL，N = 8	干劲，自我更新
miR-142-3p		向上	ITGAV、WASL、RAC1、CFL2	CL	癌细胞侵袭抑制
miR-145		下	JAM-A	CL，N = 100	癌细胞运动抑制
miR-153		下	MTDH	CL，N = 86	EMT和侵袭抑制
miR-154		下	ADAM9	CL，N = 45	细胞迁移和侵袭抑制
miR-155		向上	RHOA	CL，N = 62	EMT，紧密连接溶解，迁移和侵袭
miR-181a-5p		下	MMP14	CL，N = 40	细胞迁移抑制
miR-181a		下	uPA	CL	入侵抑制
miR-183 簇		下	BMI1	CL，AM，N = 11	干劲，自我更新	_ _
miR-191/425		向上	DICER1	CL，AM	侵袭和转移
miR-193b		下	uPA	CL，AM，N = 80	侵袭和转移抑制
miR-193a/b		下	uPA	CL	入侵抑制
miR-198		下	CDCP1	CL，N = 49	细胞粘附和迁移抑制
miR-200 簇（miR-200b/200a/429 和 miR-200c/141）		下	WAVE3	CL	侵袭和细胞迁移抑制
		下	FLI1、TCF12	CL，AM，N = 75	癌症相关成纤维细胞活化和 ECM 重塑抑制
	DNA met	下	SNAI1，SNAI2，ZEB1，ZEB2	CL，N = 70	EMT抑制
		下	BMI1	CL，AM，N = 11	干劲，自我更新
		下	SUZ12	CL，AM，N = 8	多能性
miR-200a		下	CX43	CL，N = 40	细胞迁移和转移抑制
miR-200b		下	FERMT2	CL，AM	EMT和转移抑制
miR-200c		下	ZEB1、TKS5、MYLK	CL，N = 101	EMT和invadopodia形成抑制
miR-203		下	SNAI1	CL	EMT，侵袭和转移抑制
	DNA met	下	SNAI2	CL，N = 36	侵袭和迁移抑制
	DNA met	下		CL，AM，N = 672	EMT 和干细胞特性抑制
miR-205		下	ZEB1、ZEB2	CL	EMT抑制
	DNA met	下		CL	入侵抑制
miR-206		下	CX43	CL，N = 60	细胞迁移和转移抑制
miR-221/222		下	ITGB4、STAT5A、ADAM17	CL，N = 15	侵袭抑制（管腔BC）
miR-221		向上	CDH1	CL，AM，N = 8	侵袭和转移
miR-221/222		向上	TRPS1	CL，N = 27	EMT，入侵和迁移（基底样BC）
miR-221		向上	DNMT3B	CL，N = 5	多能性和干性
miR-224		下	CDC42、CXCR4	CL	侵袭、转移抑制
DLK1-DIO3 簇 (miR-300/382/494/495/539/543/544)	DNA met	下	TWIST1，ZEB1，BMI1	CL，N = 12	EMT和转移抑制
miR-320		下	ETS2	CL，AM，N = 126	抑制肿瘤微环境重编程
miR-335		下	TNC，SOX4	CL，AM，N = 20	侵袭和转移抑制
	DNA met	下		CL，AM，N = 353	转移抑制
miR-373		向上	ITGA2	CL，N = 53	细胞迁移、转移
miR-374a		向上	WIF1、PTEN、WNT5A	CL，AM，N = 166	EMT，转移
miR-375		下	SHOX2	CL, N #	EMT抑制
miR-494		下	PAK1	CL，AM，N = 24	克隆形成能力和细胞迁移、侵袭和转移抑制
		下	CXCR4	CL	癌症进展抑制
miR-495		向上	JAM-A	CL，N = 7	癌细胞迁移
miR-506		下	SNAI2、VIM、CD151	CL	EMT、粘附、侵袭和迁移抑制
miR-539		下	LAMA4	CL，N = 40	细胞迁移抑制 (TNBC)
miR-590		下	SOX2	CL，AM，N = 49	干度
miR-661		向上	NECTIN1、STARD10	CL，N = 295	EMT，入侵
miR-708		下	LSD1	CL	增殖、侵袭抑制
	组蛋白 met	下	NNAT	CL，AM，N = 55	迁移和转移抑制
miR-720		下	TWIST1	CL，AM，N = 105	侵袭和转移抑制

缩写：met，甲基化；CL，细胞系；AM，动物模型；N，BC 患者人数；BC，乳腺癌；TNBC，三阴性乳腺癌；ECM，细胞外基质；EMT，上皮间质转化；N #，来自 Gene Expression Omnibus 的患者数据。注： miR-126* 是来自相同转录本的 miR-126 的伴侣，具有相似的表达模式 。



7. 侵入过程中的多功能 microRNA
人们普遍认为，单个 miRNA 可以调节涉及不同生物学机制的许多基因。因此，上述一些 miRNAs 在几个侵入过程中同时发挥作用。已经记录了正常细胞中 miR-200、DLK1-DIO3 和 miR221/222 簇的多种活性（图 2A-C)。这些 miRNA 的下调或上调影响其靶基因的表达，从而导致先前总结的与 BC 侵袭性和干性相关的特定过程的启动。

图 2:位于 miR-200 ( A )、DLK1-DIO3 ( B ) 和 miR221/222 ( C ) 簇中的 miRNA 的调节活性。这些 miRNA 的下调或上调会影响其靶基因的表达，从而激活启动 BC 侵袭性和干性的特定事件。红T，抑制靶基因表达；蓝色箭头，目标基因启用的表达；黑色箭头，靶基因参与与 BC 侵袭性和干性相关的特定过程。缩写：CS，细胞骨架结构；CEI，细胞-细胞外基质相互作用；TM，肿瘤微环境；EMT，上皮间质转化；STEM，癌细胞干性。注：* miR-200 簇的 miRs 没有 miR-429。
发现 miR-200 簇的成员下调与细胞骨架结构、TM、EMT 修饰和癌症干性缺陷相关。这种下调使细胞骨架重塑基因WAVE3的表达增加，其次是导致 ECM 改变的FLI1和TCF12基因，最后是SNAI1、SNAI2、ZEB1和ZEB2 EMT 基因以及BMI1和SUZ12干细胞自我更新和多能性调节剂 。此外，作为 miR-200a 的单个 miR-200 簇成员通过增加CX43的表达促进细胞骨架变化，并且 miR-200b 与 miR-200c 通过上调FERMT2和ZEB1、TKS5和MYLK基因促进 EMT 启动，分别为。_
虽然来自 DLK1-DIO3 簇的 miRNA 的下调主要影响第 5.3 节 中回顾的 EMT，但 miR-494 的缺失通过影响PAK1癌基因的表达和CXCR4趋化因子受体 。注意到的 TM 变化是由于miR-539 的下调引起的层粘连蛋白亚基LAMA4基因的表达增加 。相反，增加的 miR-495 通过抑制 JAM-A 连接粘附分子来激活细胞骨架变化 。
虽然减少的 miR-221/222 通过解除对粘附和蛋白水解分子的调节来影响细胞-ECM 相互作用（第 5.1.3 节。），但它们的表达增加通过直接或间接抑制CDH1基因来促进 EMT 诱导。这通过靶向DNMT3B促成了癌症干性，然后使NANOG和OCT 3/4基因重新表达。
几个单独的 miRNA 有助于调节侵入过程的不同组合。例如，miR-21 的上调影响细胞骨架和 TM 重组 ，而其他 miRNA，包括 miR-30a、miR-31 和 miR-34c 的下调影响了几个过程。此外，miR-30a 和 miR-34c 促进 EMT 和干性，miR-31 改变细胞骨架和细胞-ECM 相互作用，而 miR-126 和 miR-126/126* 分别影响细胞-ECM 相互作用和 TM。miR-720 在乳腺肿瘤发生中的不同功能通过其在表达 ADAM8 的 TNBC 患者血清中的表达增加来表明，其在原发性 BC 中的下调与其他与无法靶向TWIST1相关的转移性肿瘤的减少相结合EMT 基因 。
此外，一些与 BC 侵袭性相关的蛋白质能够调节上述一些 miRNA；在这里，TWIST1 充当 miR-10b 和 miR-200 簇的诱导物或阻遏物，SNAIL2 刺激 miR-221 上调，蛋白水解活性 ADAM8 激活 miR-720 表达。



8. 侵入过程中的 MicroRNA 和外泌体介导的通信
虽然在前几节中介绍了在乳腺癌细胞和基质细胞中表达的 miRNA 的活性，但 miRNA 还可以通过其外泌体介导的转移到其他细胞来影响侵袭过程并在那里发挥全部功能 。
外泌体被定义为内吞来源的纳米囊泡，它们由所有类型的细胞主动分泌。它们转移蛋白质、mRNA 和 miRNA，从而促进许多生物活动，包括细胞间通讯和癌细胞侵袭。此外，目前的结果表明，肿瘤细胞衍生的外泌体在癌症进展、侵袭和转移中具有重要作用。
来自人类 BC 细胞系的外泌体中某些 miRNA 的水平显着增加，例如 miR-21 和 miR-1246，与健康对照组的血浆外泌体相比，在 BC 患者的血浆外泌体中发现了这些更高的水平 。BC 亚型中选定的外泌体 miRNA 的血清水平分析在更具侵袭性的 TNBC 中也发现了更高浓度的 miR-373 。
已在细胞系模型中观察到通过由传递 miR-10b 的转移性 BC 细胞分泌的外泌体刺激非恶性乳腺细胞的侵袭特征。通过抑制其靶基因HOXD10和KLF4  ，证明了 miR-10b 在非恶性细胞中的功能。此外，最近的研究表明，与正常成纤维细胞相比，从 CAF 获得的外泌体中增加的 miR-21、miR-378e 和 miR-143 水平有助于形成侵袭性 BC 细胞表型 。其他作者报道，在许多 BC 细胞系中高表达的 miR-9 会影响正常成纤维细胞向 CAF 的转换，肿瘤细胞分泌的 miR-9 可以通过外泌体转运至受体正常成纤维细胞并导致增加细胞运动。与正常成纤维细胞相比，从 TNBC 患者分离的 CAF 中也发现了 miR-9 的上调 。上调的 miR-9、miR-10b、miR-21 和 miR-373 在 BC 侵袭的特定过程中的参与先前已在本节提到的 miRNA 中进行了描述。
此外，肿瘤相关巨噬细胞通过巨噬细胞分泌的外泌体促进 BC 侵袭性，这些外泌体可以将致癌 miRNA 转运到 BC 细胞中 。此外，在 BC 衍生的外泌体细胞中也发现了将前 miRNA 加工成成熟 miRNA 的独立能力。外泌体含有 pre-miRNA，具有 DICER、AGO2 和 TRBP 蛋白，从 BC 患者的细胞和血清中分离出来的外泌体以 DICER 依赖性方式刺激正常上皮细胞发展为肿瘤 。



9. microRNA 的临床潜力
在过去的二十年中，对 miRNA 与癌症的关联进行了大量研究，并在 miRNA 生物发生和肿瘤样本中 miRNA 表达的癌症特异性改变方面取得了重要发现。循环中的 miRNA 被确定为潜在的生物标志物，基于 miRNA 的癌症治疗也取得了一些进展 。许多研究人员试图利用异常的 miRNA 表达谱来识别癌症或亚型的疾病状态，而 miRNA 的谱分析增强了对多种癌症的精确分类 。例如，在 BC 的早期阶段鉴定了一组 miRNA，并且在两项独立研究中定义了 miRNA 的不同组合，用于区分 ER、孕酮受体 (PR) 或 HER2 状态 。许多作者还使用不同的检测平台进行 miRNA 量化，他们努力利用逐渐确定的 miRsupps 和 oncomiRs 异常表达谱来开发新的诊断、预后或预测性生物标志物。
几项研究表明，乳腺肿瘤发生过程中的动态变化以及几种 miRNA 的癌基因和肿瘤抑制因子的双重作用可能会影响基于 miRNA 的潜在标志物的评估。此外，目前的研究侧重于更详细地检查单个 miRNA 靶基因以及 miRNA 与关键癌基因、肿瘤抑制基因和调节基因之间的相互作用。研究癌症相关 miRNA 同种型和外泌体介导的 miRNA 转移到其他细胞与癌症侵袭性相关的作用也很明显。这些结果都有助于建立一个更复杂的网络，这对于个性化医疗的新策略应该是有用的。
RNA依赖性治疗也取得了重大进展。数十种具有肿瘤抑制作用的小干扰 miRNA 和致癌反义寡核苷酸已被测试用于开发新的抗癌药物，目前已在 I 期或 II 期临床试验中评估了几种 miRNA。miR-16、miR-29 和 miR-34 的模拟物已被用于靶向间皮瘤和非小细胞肺癌、硬皮病和多个实体瘤，并且抗 miRs 103/107、122 和 155 已经过测试和分别用于治疗糖尿病、丙型肝炎和皮肤 T 细胞淋巴瘤 。然而，所有已开发的抗癌治疗药物中只有 16% 进入 III 期试验，而 FDA 通常仅批准其中的 10.4% 。不幸的是，四分之一的 RNA 靶向治疗尚未在人体临床试验中进行研究，这些药物目前都没有获得 FDA 的批准 。



10. 乳腺癌miRNA基因检测分析结论
越来越多已鉴定的人类 miRNA 列表引发了极大的期望，即高级研究将提高对正常和病理过程中 miRNA 调控基因表达的复杂性的理解。人们很容易接受 miRNA 表达谱的变化有助于许多人类疾病的发展，包括癌症。女性恶性肿瘤相关死亡的高发生率（主要与 BC 相关）和相对较高的转移百分比突出表明迫切需要在更深的分子水平上了解以下机制：癌细胞从原发部位脱离，在体内传播和传播次级器官，以及相关基因的miRNA调控。
乳腺癌miRNA基因检测行动小组的综述总结了关于 miRNA 及其靶向基因表达的最新数据，这些基因在涉及乳腺癌侵袭性和癌细胞干性的过程中发挥作用。然后，乳腺癌miRNA基因检测行动小组专注于单个 miRNA 的表观遗传失调及其与其他调节基因的修饰相互作用。除了许多计算机、体外和体内研究外，乳腺癌miRNA基因检测行动小组评估的大多数 miRNA 还在 BC 患者样本中进行了研究。转移研究的积极进展反映在越来越多的癌症患者血浆样本的无细胞 miRNA 表达研究中，这些研究未包括在乳腺癌miRNA基因检测行动小组的审查中。
最后，尽管用于量化 miRNA 表达的可变检测方法和分析解释带来的挑战，乳腺癌miRNA基因检测行动小组已建立的结果可以成功地促进患者管理并最终延长患者的生命。
 


Cells. 2019 Nov; 8(11): 1361.Published online 2019 Oct 31. doi: 10.3390/cells8111361; PMCID: PMC6912645;PMID: 31683635;MicroRNAs Contribute to Breast Cancer Invasiveness

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