【佳学基因检测】FISH基因检测在不同实体肿瘤应用分析

根据《如何选择不同的基因检测方法以达到个性化治疗的目的》，荧光原位杂交建立于 20 世纪 80 年代，是一种可用于检测各种异常的技术，例如基因融合以及基因组增益和缺失。由于逐步实施的改进，该方法已经产生了重要的信息，不仅可用于更精确的患者诊断，还可用于匹配最佳疗法。一些很好的例子包括对 TKI 治疗所需的肺癌进行 ALK 和 ROS1 基因的基因测试。 2018 年 ASCO 建议接受对这种肿瘤进行 ALK 的 IHC 检测，只要结果明显呈阳性或阴性即可。对于 ROS1 阳性和 ALK 弱染色，建议采用 FISH 方法作为决定性方法。还使用其他非原位方法，例如 RT-PCR（逆转录酶聚合酶链式反应）或 NGS（下一代测序），例如用于搜索肺癌中的畸变。前一种方法具有较高的灵敏度和特异性，但面临许多与从 FFPE 样品或众多基因伴侣中分离核糖核酸相关的问题。后者似乎更优越，因为它需要少量的 RNA，甚至来自 FFPE 样品，并且将灵敏度和特异性保持在 100% 的水平。与上述 IHC 和 FISH 相比，化学和设备的高成本以及由医学实验室遗传学专家对结果进行复杂的分析和解释仍然使 NGS 成为一种可能的支持性而非常规技术。迄今为止，永恒且无成本的荧光原位杂交仍然是金标准，例如在非小细胞肺癌中。

FISH方法在肺癌肿瘤基因检测中的应用

NSCLC（非小细胞肺癌）是具有众所周知的遗传和表观遗传致癌机制的肿瘤的一个例子。癌症基因组图谱项目已帮助确定 NSCLC 中最常见的基因组改变，其中包括原癌基因的点突变和结构重排，例如：EGFR（表皮生长因子受体）、KRAS（KRAS 原癌基因，GTPase）、BRAF（B -Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶）、MET（MET原癌基因、受体酪氨酸激酶）、ALK、RET（ret原癌基因）、ROS1（ROS原癌基因1、受体酪氨酸激酶）、MYC（MYC原癌基因），bHLH 转录因子）。例如，EGFR 基因突变发生在高达 15% 的欧洲患者和 9%–10.62% 的波兰患者中。此外，如果涉及最常见的伙伴 EML4（EMAP 类似 4）基因，那么最常见的 ALK 激酶内的重排通常占病例的 3%–7% 左右。这种情况分别占欧洲和波兰患者的 2.7%–7.5%和 2.82%–4.5%。

ALK基因在实体瘤基因检测中的应用

ALK 激活有三种方式。第一个被认为是 NSCLC 肿瘤发生的原始事件，涉及 2 号染色体短臂的许多结构重排，包括基因座 2p23。倒位 inv (2) (p21p23) 导致 ALK 和 EML4 基因之间的基因融合。对于 EML4-ALK 融合，至少已识别出 15 种不同的变体。更重要的是，这个嵌合转录本只是 22 种可能的融合产物之一。其他潜在的易位伙伴包括以下基因：KLC1（驱动蛋白轻链1）、KIF5B（驱动蛋白家族成员5B）、TFG（从内质网运输到高尔基体调节器）。重排的 ALK 基因的断点位于激酶结构域，通常位于外显子 20 内。

第二个激活机制是 ALK 基因座的增益。从视觉上看，在 FISH 分析中，它们被观察为未重排的 ALK 基因座的额外拷贝。它们与多体性的不同之处在于，在至少 10% 的分析细胞群中，每个细胞至少存在 10 个基因拷贝。在高达 63% 的患者样本中，在相当大比例的细胞中（从 50% 到 95%）观察到它们。

第三种已知的激活机制是突变。 ALK 基因突变（例如 L1196M）会改变蛋白质结构，从而阻止蛋白质结合药物分子。约 25%–30% 的病例中 ALK 突变导致 TKI（酪氨酸激酶抑制剂）治疗耐药，而 ALK 扩增则占 15%。最后两种机制在对 ALK-TKI（例如克唑替尼）继发耐药的患者中观察到。两者共存是可能的。

使用 FISH 技术可以检测 ALK 重排或增益。由于探针的特殊结构（位于 ALK 基因断点两侧的两个差异标记的短 DNA 序列），该方法足以检测大量融合变体。探针的红色和绿色部分之间的短距离产生重叠信号或融合信号的图像。当 5' 和 3' 部分之间的距离超过信号直径的两倍时，即可识别出重排。这一原则有时可能会导致分析的不确定性，因此通过外部质量控制评估至关重要。当从至少四个显微镜视野计数的 50 个细胞中有超过 25 个细胞 (50%) 表明至少一种基因融合中出现上述红色和绿色信号分离时，结果被认为是真正阳性。当在 5-25 个细胞 (10%-50%) 中观察到异常时，结果被认为是模棱两可的。第二位分析师对 50 个新细胞进行的分析表明，当分析的 100 个细胞中超过 15 个细胞 (15%) 出现异常时，结果为阳性。

ALK 基因遗传异常的鉴定（与既定疗法相关）由美国食品和药物管理局 (FDA) 验证和批准的测试（包括 FISH）确认。 ALK 检测的潜力延伸到寻找克唑替尼耐药的可能机制，据信这不仅与突变有关，还与融合扩增有关，例如 EML4-ALK。因此，该标志物的诊断可能有助于下一代 ALK 抑制剂的开发。

FISH技术检测ROS1基因的突变形式

NSCLC 中的另一个肿瘤发生途径是 ROS1 基因的重排。首次在胶质母细胞瘤细胞系中发现了该基因的破坏。 ROS1 重排在靶向治疗中的作用与 ALK 重排一样重要，尽管它们仅代表 0.9% 的腺癌和 2% 的 NSCLC 病例。 ROS1 基因参与与其他基因的易位，位于许多染色体位点上。目前，已确定14种不同的基因伴侣，例如：EZR（ezrin）、GOPC（高尔基体相关PDZ和含有卷曲螺旋基序）、KDELR2（KDEL内质网蛋白保留受体 2)、LRIG3（富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域 3）、SDC4（syndecan 4）、TPM3（原肌球蛋白 3）等。在每一种这样的易位中，包括SLC34A2（溶质载体家族34成员2）基因的重排和最常见的CD74基因的重排，ROS1基因的端粒部分转移到融合伴侣基因或被删除。因此，激活的激酶增强肿瘤细胞的增殖，同时也保护它们免于死亡。

通过使用分离探针的 FISH 可以评估 ROS1 基因状态。与 ALK 基因类似，如果探针两个不同标记末端的间隔大于信号直径的两倍，或者在至少一个非标记旁边观察到基因 5' 末端的缺失，则确定阳性结果。 -重新排列的信号。 ROS1 基因重排必须在所分析的细胞核群体中至少发生 15%，才能确保患者呈 ROS1 阳性。

根据NCCN（国家综合癌症网络）2018年发布的最新建议，在使用TKI抑制剂之前需要检测ROS1重排，就像ALK阳性患者一样。克唑替尼用于转移性和晚期 NSCLC 显着提高缓解率。

c-MET基因突变是如何采用FISH基因检测技术的？

在肺癌以及肾癌、胃癌、结肠癌和非小细胞肺癌等其他肿瘤中，观察到 c-MET 基因过度表达。 c-MET原癌基因属于跨膜蛋白，在与c-MET的配体HGF（肝细胞生长因子）结合后，激活MAPK（丝裂原激活蛋白激酶）信号通路。基因的激活有几种可能的方式，例如：扩增、激活突变、转录调节以及与配体相关的自分泌或旁分泌调节。当基因位点的额外拷贝和/或基因突变出现时，该信号就会增强，从而导致更强的细胞增殖和细胞凋亡的阻断，从而促进肿瘤进展。这些改变中的每一个都会导致蛋白质的永久磷酸化，从而导致其组成性激活。

c-MET 基因座的增加（≥5 个拷贝/核）发生在 NSCLC 中，频率为 8%–10%。将异常类型识别为拷贝数畸变与扩增取决于所使用的技术。在 MLPA（多重连接探针扩增）中，7% 的 NSCLC 中出现 c-MET 位点获得，而 5% 的病例中出现 ≥4 个拷贝的扩增。由于探针与测试基因位点和 7 号染色体着丝粒的控制区域互补，因此可以评估 FISH 中的 c-MET 基因拷贝数。如果 c-MET/着丝粒 7 的比率结果≥2 或如果观察到超过 4 个 c-MET 位点拷贝，则对约 100 个肿瘤细胞进行显微镜分析证实扩增。根据其他参考文献，80% 的细胞应呈现超过 6 个基因拷贝，并且比率结果超过 2。

c-MET 基因的过度表达与治疗的不良反应有关，例如在对 TKI 耐药的 EGFR 阳性患者的治疗中。

如何使用FISH实现对神经胶质瘤的个性化治疗？

胶质瘤是最常见的新发脑肿瘤类型，其发生率达到所有脑肿瘤的 30%，其中包括所有神经系统的 80%。 2007年，中枢神经系统肿瘤分类提出了四级肿瘤侵袭性WHO分类。该分类的最新第五版不仅考虑了组织学分析，还考虑了遗传畸变。这种方法有助于将星形细胞肿瘤和少突胶质细胞肿瘤病例分类为一类，因为 IDH1/2（异柠檬酸脱氢酶 (NADP (+)) 1/2）基因突变发生在这两种类型中。进一步的分型需要依赖于每一种肿瘤类型的特有的基因突变。少突胶质细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤存在 1p/19q 编码缺失，而星形细胞瘤则存在 ATRX（ATRX 染色质重塑蛋白）和 TP53（肿瘤蛋白 p53）基因突变。

1p/19q 的共缺失被解释为同一细胞中 1 号染色体短臂和 19 号染色体长臂存在染色体缺失，1994 年首次被认为是神经元肿瘤的肿瘤标志物。 1p 和 19q 缺失的共存是不平衡易位 t(1;19) (q10;q10) 的结果。可以使用基于肿瘤细胞培养和 G 带（吉姆萨带）的常规细胞遗传学方法来检测畸变，但更频繁地使用 FFPE 上的 FISH。易位的性质可以使用 1 号染色体 α 卫星 (CEP1) 和基因座 19q12 探针进行测试。在常规细胞遗传学-分子诊断中，使用包含两种探针的试剂盒：1p36/1q25 和 19p13/19q13。每组需要对每对染色体至少 100 个不重叠的细胞核进行分析。结果解释基于国际儿科肿瘤学会 (SIOP) 制定的神经母细胞瘤标准。对于 1p36/1q25 以及 19q13/19p13，计算出的包含缺失的细胞百分比必须高于 50%，比率低于 0.75%–0.8%。检测共缺失的替代方法包括 CGH（比较基因组杂交）或基于微卫星序列的杂合性丢失（LOH）分析。除了1p19q畸变外，还可能出现额外的不平衡，例如11、17、21、22号染色体的三体性和14、15、18号染色体的单体性。

1p/19q 的共缺失在区分少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤方面起着决定性作用，这对于组织学上困难的病例特别有帮助。遗传标记也具有预后价值。

FISH基因检测如何构成乳腺癌精准医学基因检测的重要内容

乳腺癌（BC）是女性中最常见的肿瘤类型。此外，它是世界上这组患者的主要死亡因素之一，欧洲的五年生存率为 57.9%–82%，具体取决于国家，波兰为 77.2%。

ERBB2（erb-b2 受体酪氨酸激酶）基因，通常称为 HER2，是一种原癌基因，编码参与一些信号通路的细胞受体，例如细胞分裂和活力。 HER2 的一个显着异常是该基因出现额外拷贝，定义为扩增。这种畸变的结果是该蛋白过度表达，该蛋白存在于约 22%–28% 的 BC 中和 8.2%–53.4% 的胃癌中。虽然可以使用 IHC 进行蛋白质的常规分析，但使用金标准 FISH 对 FFPE 样品或 CISH 评估基因拷贝数。 HER2 基因的状态评估遵循美国临床肿瘤学会和美国病理学家学会 (ASCO-CAP) 于 2007 年首次定义的指南。根据2018年的最新版本，HER2/CEP17（着丝粒17）比率≥2.0时才考虑扩增，每个细胞至少有4个HER2基因拷贝。对于比率 <2 且每个细胞至少有 6 个 HER2 基因拷贝，最终结果仅对 IHC3+ 呈阳性，或者当新观察者对至少 20 个细胞进行的附加分析证实相同结果时（比率 <2 和对于 IHC2+，≥6 个 HER2 信号/核）。类似的程序也涉及模棱两可的结果，仍然定义为比率 <2 和 HER2/CEP17 ≥4 且 <6 的组合。在这种情况下，再次进行 IHC3+ 结果有助于最终诊断为 HER2 阳性。然而，对于 IHC2+ 结果，只有对至少 20 个比率≥2.0且 HER2/CEP17>6 的细胞进行额外分析的结果才与该基因的 HER2 扩增状态一致。这种临界情况出现在大约 10%–17% 的 FISH 分析中。

虽然同时对 HER2 基因座和着丝粒 17 使用两种不同标记的探针似乎是最佳解决方案，但结果可能不仅反映了分析的肿瘤细胞群体中 HER2 的扩增，还反映了 HER2 基因的共同扩增。 17号染色体的较大部分。多体性事件被定义为每个细胞至少有3个17号染色体着丝粒的拷贝，在12%–46%的乳腺癌病例中观察到。此外，它在 IHC2+ 病例中很常见。他们还有其他检测区域与对照区域之间距离较大的HER2基因探针，例如RARA（视黄酸受体α）—17q21.2、RAI1（视黄酸诱导1）—17p11.2、TP53–17p13。

HER2 基因位点的 FISH 检测对于乳腺癌患者具有明确的价值。使用 FDA 批准的 IHC、CISH 或 FISH 方法之一评估 HER2 基因并进行比较后，可以使用个体化治疗。治疗包括抑制剂或人源化单克隆抗体（例如帕妥珠单抗、曲妥珠单抗）。 HER2 过度表达或扩增的结果表明需要开始靶向治疗。在这种情况下，个性化医疗有助于治疗的成功，提高总体生存率并延长进展和转移的时间。此外，由于将治疗集中于 HER2 阳性患者，乳腺癌治疗的总体成本降低了。

卵巢癌精准医学如何使用FISH基因检测结果？

卵巢癌是一种具有多种临床特征的异质性肿瘤，其中最典型的是上皮细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤和特化间质细胞肿瘤。第一种类型反映了大多数病例，分为低级别子宫内膜样癌I型（逐渐生长且预后良好）和高级别非子宫内膜癌II型（进展快且对治疗有不良反应）。上皮型的主要形式是极具侵袭性的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）。其发病机制在于 TP53 基因的突变，该基因被认为是致癌的主要事件，而且还在于 BRCA1（BRCA1 DNA 修复相关）和 BRCA2（BRCA2 DNA 修复相关）等基因的突变，参与了双重作用的可靠机制。链断裂 (DSB) 修复称为同源重组 (HR)，最后是拷贝数改变，包括 CCNE1（细胞周期蛋白 E1）基因的额外拷贝。该基因的蛋白质产物细胞周期蛋白 E 通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (Cdk2)、Rb 蛋白磷酸化和 E2f-1 依赖性转录参与 G1 期和 S 期之间的细胞周期转换。 CCNE1 表达增加会刺激 DNA 不受控制的复制、中心体扩增并增强染色体不稳定性。

CCNE1 基因拷贝数的评估基于 FFPE 上的 FISH，使用针对位于 19q12 的目标基因和同一染色体 (CEP19) 着丝粒的控制区域的位点特异性探针。至少 50 个完全暴露的原子核接受分析。如果超过 20% 的肿瘤细胞出现 CCNE1/CEP19 比率≥2 的扩增状态，或者≥40% 的分析细胞中存在 ≥4 个 CCNE1 拷贝，则样本被视为阳性作为高度多体性。有趣的是，透明细胞癌和高级别浆液性癌病例中扩增的基因位点的分布情况有所不同。在前者中，额外的拷贝很容易计数，这表明双分钟 (dm) 类型的扩增，而在后者中，信号没有清晰的轮廓，并且通常不可能像在均匀染色区域 (hsr) 中那样进行精确的数量评估类型。这些差异表明获得 CCNE1 基因额外拷贝的两种方式。

CCNE1 测试很有价值，原因有几个。首先，由于透明细胞癌病例中发生过度表达，该测试可能有助于与其他基于子宫内膜异位症的卵巢肿瘤相鉴别。其次，CCNE1 的增加可能是透明细胞癌中短生存率的预测因子。第三，已确定 CCNE1 增益的患者可能会接受靶向治疗。由于治疗选择的可用性，最后一个原因似乎发挥着重要作用。如果存在 CCNE1 扩增，通常使用基于铂的细胞毒性药物会导致对治疗不敏感。寻找抑制CDK的新分子，例如CDK2，可能会给卵巢癌患者带来一些好处。

FISH基因检测软组织肉瘤提供更有效的治疗方案

软组织肉瘤 (STS) 是一种罕见的癌症，发病率为 3.58–6.1/100,000。在许多情况下，它们复杂的生物学阻碍了肿瘤类型的正确识别。因此，需要免疫组织化学和组织学分析。虽然基因检测不是主要的诊断工具，但它对最终诊断有重要支持。这些测试的价值已在许多肉瘤的 WHO 分类中得到认可，其中关键基因序列已被确定，例如尤文肉瘤 (ES)。

在分子水平上，ES 的特点是 EWSR1（EWS RNA 结合蛋白 1）基因的重排。该基因有几个属于 ETS 转录因子家族的易位伙伴，例如位于 11q24 位点的 FLI1（Fli-1 原癌基因，ETS 转录因子）基因或 ERG（ETS 转录因子 ERG）基因位于 21q22 位点。 EWSR1 基因与其伴侣的易位是致癌的原因：细胞代谢和增殖的变化以及细胞凋亡的阻断。

另一种肉瘤——滑膜型 (SS)——以 SS18（BAF 染色质重塑复合体的 SS18 亚基）基因异常为代表，例如由于 t(X;18) (p11.2;q11.2) 易位所致。 SSX1（SSX 家族成员 1）和 SSX2（SSX 家族成员 2）等基因伴侣决定 SS 的组织学亚型：分别为单相型和双相型。据观察，SYT-SSX1 融合的患者生存期更长。

在上述两种肉瘤中，可以使用分离探针和 FISH 技术评估基因状态。由于探针的结构，所要求的图像应该显示在分析的 50 个肿瘤细胞中超过 14 个 EWRS1 基因的融合信号和至少 10 个 SS18 基因的细胞中的融合信号分离。

基于识别基因重排或特定基因融合的FISH检测可以区分病理诊断，这对于低分化肉瘤特别有帮助，例如，一些SS肿瘤可能类似于EWS的小圆形细胞，但在遗传上具有SS18基因的重排。诊断的正确性直接影响疗程和患者的预后。

隆突性皮肤纤维肉瘤（DFSP）是一种罕见的间叶组织肿瘤。在2013年发布的最新WHO软组织肿瘤分类中，DFSP被归入成纤维细胞/肌纤维母细胞肿瘤的中间组。病变经常复发并导致重复手术。转移大多出现在具有纤维肉瘤成分的病例中。此类肿瘤的诊断基于体检，然后进行形态学和免疫组织化学检测。然而，自从发现大部分病例存在遗传异常以来，基因检测已成为一种有用的诊断程序。在 68%–96% 的隆突性皮肤纤维肉瘤病例中，17 号和 22 号染色体之间发生易位。这种畸变的结果是 COL1A1（I 型胶原蛋白 α1 链）基因与 PDGFB（血小板源性生长因子 B 亚基）基因的融合。融合主要导致 PDGFB 表达增强，但也会强烈激活该配体 PDGFRB 的受体并刺激间充质细胞增殖。可以通过使用双色双融合探针的 FISH 方法检测异常。当观察到两个不同标记位点的信号重叠为黄色信号时，如果它影响至少 10% 的分析细胞，则结果被认为是阳性。或者，可以使用分体式探针来测试 PDGFB 基因座。至少 10% 的细胞中与测试基因座互补的信号分离证实了该基因座的重排。

COL1A1-PDGFB 融合蛋白的诊断在未来的治疗决策中起着至关重要的作用，因为它是开始基于甲磺酸伊马替尼治疗的指征。该抑制剂可用于无法手术、转移性和复发性皮肤纤维肉瘤病例，似乎也是一线治疗的一种选择。