【佳学基因检测】自闭症基因检测怎么做？准确和全面是标准

自闭症与基因突变位点的关系建立是基因检测准确性的保障

佳学基因检测通过研究基因突变与自闭症发生的关系的研究来确立自闭症与基因检测位点的关系。其中的一个研究样本来自两个不同时间点的家庭。第一个时间点涵盖了79个家庭，这些家庭曾参与过之前的自闭症发病原因研究，我们称之为第一波。第二个时间点包括了另外32个家庭，这些家庭在2014年之后加入到我们的研究中，我们称之为第二波。最初，自闭症发病原因研究的目标是确定与DSM-IV中自闭症障碍、语言障碍及相关疾病相关的遗传变异。参与研究的家庭中至少有一名自闭症患者和一名语言学习障碍患者。在第一波期间，我们严格按照自闭症诊断访谈（ADI-R）、自闭症诊断观察表（ADOS）和诊断和统计手册-IV（DSM-IV）的标准对自闭症患者进行了诊断（美国精神病学协会，2000年）。第二个先证者必须符合特定的语言障碍（SLI）标准，这是一种语言发育迟缓或异常且无法用其他神经发育诊断解释的疾病。对于第二波，我们试图了解是否有必要严格按照最初的自闭症诊断标准，因此我们有意放宽了自闭症患者的要求，使其更符合较新的自闭症谱系障碍DSM-5标准（美国精神病学协会，2013年）。所有参与者都经过知情同意或同意，并且符合基因检测研究机构的伦理审查委员会的人类受试者治疗指南（IRB编号：13-112Mc）。

对于自闭症谱系障碍（ASD）的先证者，我们通过入院访谈与儿童精神病学家或发育儿科医生确定了ADHD特征。在每个案例中，我们通过详细的自闭症发病原因病史调查问卷确认了诊断，该问卷询问父母是否曾诊断他们的孩子患有注意力缺陷障碍（ADD）和/或ADHD。对于所有其他家庭成员，父母完成了同样详细的家族史调查问卷和语言相关调查问卷，以确定他们或他们的孩子是否被诊断为患有多种不同的神经发育或神经精神疾病，包括注意力缺陷多动障碍/多动症。在所有问卷中，我们将ADD和ADHD视为一种，统称为ADHD。

DNA提取

DNA的提取是由佳学基因检测机构从血液DNA（WB）或淋巴母细胞系（LCL）中进行的，淋巴母细胞系传代数为3-6次。我们的分析包括了两个阶段，第一阶段使用了Affymetrix Axiom阵列基因分型实验，第二阶段使用了Illumina Infinium PsychArray-24 v1阵列生成的SNP数据。所有样本都经过了严格的质量控制，以确保准确性。全基因组测序则涉及了多个批次，使用了Illumina双端测序，覆盖度为30倍人类基因组。在所有分析中，我们只考虑与CEU样本聚类的样本，因为质量问题，一些样本被排除在外。

最初，我们从第一波和第二波阵列中共同择取了10,899个SNP子集进行连锁分析，以最大程度地减少标记之间的连锁不平衡，同时保留高于30%的主要等位基因频率（MAF），以确保充分覆盖重组基因组事件。由于一些基因组区域的重叠较低，无法维持MERLIN测量的信息质量，在这些区域中，我们包含了阵列特异的SNP。这一过程不会导致家族内数据的缺失，因为每个家族只使用单一类型的阵列进行基因分型。

全基因组测序

全基因组测序由分为四批次进行。所有样本都以Illumina双端格式进行测序，覆盖率为30倍人类基因组。与连锁分析相似，WGS分析只包括与HapMap参考数据的CEU样本聚类相对应的样本。由于质量问题，一些样品在下游分析中被排除。同时，一些样本由于受试者退出研究而被废弃。对于多批次测序的样品，我们使用最高质量的运行进行分析。所有样本的原始测序读数、变异和基因型都可以在国家心理健康研究所数据档案（NDA）的实验C1932和C2933中获取。

连锁分析是使用KELVIN（v2.3.3）进行的。KELVIN利用后验连锁概率（PPL）度量来评估遗传位置与测试性状相关的概率。我们分别对每个波进行了主要连锁分析，并使用贝叶斯规则在波之间顺序更新连锁证据，以提供单一度量的连锁证据。在每个性状的单一汇总分析中，我们联合使用了所有家族进行二级连锁分析。通过将连续更新的结果与汇总结果进行比较，我们可以对数据集中异质性的作用进行定性推断。由于对不相关性状进行分层平均通常会产生与汇总分析相似的结果（Govil和Vieland，2008年），因此，如果连续更新的PPL明显高于汇总结果，则可能存在由波划分的异质性。

根据对NJLAGS样本中零分布进行的模拟，0.32或更高的PPL与p < 0.001的全基因组错误率（PPL为0.26）一致。对应于p < 0.01，PPL 0.11对应于p < 0.05。这些阈值类似于之前针对多个性状测试进行校正后的PPL假阳性率研究。

小变体（SNV/indel）和 SV 调用

使用BWA-MEM算法（v0.7.12）将配对末端FASTQ文件与人类基因组参考联盟Build 37（hg19）进行比对。然后，使用SAMtools视图（v0.1.19）将输出转换为BAM格式。接下来，按照比对处理和变体调用的最佳实践建议，使用GATK v3.5.0变体调用管道处理来自读取比对的BAM文件。从排序和索引的单个BAM文件开始，进行了一系列GATK比对处理程序，包括PCR重复去除和碱基质量评分重新校准。对每个个体使用HaplotypeCaller进行SNV和小插入/缺失（indel）的调用，在GenotypeGVCF联合调用之前。所有样本与1000个基因组计划欧洲血统样本（CEU、GBR、FIN）一起被联合调用作为对照，以减少下游分析的批次效应。变体调用后，使用VariantRecalibrator和ApplyRecalibration进行变体质量分数重新校准。

对于SV调用，单一算法的工具一直面临挑战。因此，我们使用集成算法MetaSV及其组件（Breakseq2、霹雳舞者、CNVnator和Pindel），用于SV的发现。通过SPAdes和AGE进行局部重新调整，以提高断点分辨率。然后，MetaSV将所有产生的证据合并到一个调用集中。使用VCFtools将同一个体的不同染色体的输出合并回一个文件。SV调用的基本统计数据由SURVIVOR计算以进行质量控制。然后，过滤SV以选择具有来自MetaSV中至少两个SV调用者的共识调用的SV。

变异注释和选择

SNV 和 indel 通过 VAAST 包中的 VAT 进行注释，并通过 VST 压缩为 CDR 文件以代表每个家族。这些变体经过过滤，包括 ExAC 数据集中 MAF < 5% 的变体，不包括精神病队列。对于对照样本，从 GTEx 项目获得了 635 个 GTEx WGS 样本，并将其浓缩为一组。SV 调用由 AnnotSV 进行注释。

基因优先排序

对于 SNV 和插入缺失，使用 pVAAST 工具对候选基因进行优先排序。根据每个基因的变异连锁模式、关联证据、MAF 和功能预测计算 pVAAST 评分。在显性和隐性遗传模式下，对两个 ADHD 连锁区域和整个基因组进行了 pVAAST 分析。为了运行 pVAAST，对谱系进行了处理和修剪，以包括每个谱系的一对祖先父母的个体（显性模式）或谱系的两代子集（隐性模式）。选择个体是为了最大限度地增加每个家庭中已测序和受影响的样本的数量。

选择至少一个脑表达数据库中表达的候选基因进行下游分析。对于连锁区域，选择 Bonferroni 校正 p 值 < 0.05 的候选基因。对于全基因组分析，选择 pVAAST 分析中 p 值 <= 10^(-5) 且 LOD 得分 >= 1 的候选基因进行下游分析。

对于 SV，AnnotSV 注释提供了潜在致病性的排名分数。选择预测可能致病（4 类）或致病（5 类）的 SV。在每个个体中，第 4 类和第 5 类 SV 的严重性评分计算如下：严重性评分 = (class − 3) * SV 拷贝数，其中杂合 SV 的拷贝数设置为 1，纯合 SV 的拷贝数设置为 2 SV。使用自定义脚本将基于 SV 的报告的结果转换为基于基因的报告。对于每个基因，与给定基因重叠的所有 SV 的注释严重性分数分别针对受影响的个体和未受影响的个体进行汇总。根据受影响个体的汇总 SV 严重程度评分对基因进行排序。使用以下标准选择基因进行下游分析： 1. 在多个受影响个体中含有 SV； 2. 在至少一个脑表达数据库中表达； 3. SV(s)与外显子区域重叠； 4. 受影响个体的总分高于未受影响个体。

基因注释、通路和富集分析

对于基因功能预测，从每个基因的 gnomAD 中提取 pLI（功能丧失不耐受的概率）评分。大脑发育基因表达数据来自 GTEx 项目、BrainSpan Atlas，以及人类发育生物学资源。基因与特定细胞或疾病的关联是通过 HumanBase 算法从大型基因组数据集合中学习来预测的。基因敲除小鼠行为数据从国际小鼠表型联盟（IMPC）下载。候选基因、基因集和基因总结在表中。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络是根据三个数据库的基因相互作用生成的，包括 STRING、GIANT 和 ConsensusPathDB。对于 STRING，综合评分的截止值设置为 700。对于 GIANT，使用了大脑和神经元系统组织中评分 > 0.6 的相互作用。Python NetworkX 包用于可视化 PPI 网络，并保存网络中基因的位置，以便使用 R 包 ggplot2 和 scatterpie 进行最终绘图。先前描述了交互数据下载和处理过程的详细信息。

使用 ConsensusPathDB 提供的过度代表性分析进行基因集富集分析。所有通路、基因本体（GO）和基于蛋白质复合物的富集分析均已启用，输入中的最少两个基因和 p 值截止值设置为 1。所有基因的富集 p 值均由 ConsensusPathDB 使用每个基因列表的超几何检验和 Fisher 精确检验计算。如果满足以下条件，则选择富集术语进行进一步分析：1) 属于该术语的基因总数 ≤ 500；2) 该术语包括来自所有输入基因的三个以上基因（ADHD、ASD/ADHD 和 NDD 基因）；3) ADHD 和/或 ASD/ADHD 基因列表的富集 p 值 < 0.01。