【佳学基因-基因检测】实时荧光定量PCR技术简介与应用

【佳学基因-基因检测】实时荧光定量PCR技术简介与应用

 

 

实时荧光定量PCR，英文全称是Real Time Flurocent Qualitative PCR,简称RT-QPCR,或者更简洁地称之为Q-PCR 或者是RT-PCR 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，被广泛应用到生物学和医学的各个领域， 不仅涉及到对DNA的定量， 核酸多态性分析， 基因突变分析等，同时对染色体病的诊断、基因病的诊断、肿瘤研究以及用药评估方面都有广泛应用。肿瘤基因检测哪里做？

实时荧光定量PCR技术有很多优点，例如特异性好、准确性高、灵敏度高、可定量检测、 误差小、操作简单、自动化程度高、交叉污染和污染环境机会少等。 同时因不需杂交、电泳、凝胶成像,在实验进行的过程中就可以真实地展现出实验结果。此外， 实时荧光定量PCR技术在动物检疫和环境监测等方面也得到了广泛的应用， 使人们的健康得到保障， 同时， 也可使人们深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。肿瘤基因检测哪里做？

荧光定量PCR，（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通过在PCR管中、96孔板或者是384孔板的微型小孔中加入能够指示反映进程的荧光探染料或者探针，对反应的过程中通过代表反映产物的荧光信号的强弱来快速直观地知道待测DNA的量。可以通过信号产生的时间、出现的位置来进行相对定量。如果设置不同浓度的标准品，还可以进行绝对定量。

 

同PCR设计时的三温度反应法，qPCR技术的全部反应过程在一个可以进行良好控制的环境中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术。

 

所使用的荧光物质可分为：TaqMan荧光探针、分子信标和荧光染料。

 

1)TaqMan荧光探针：

 

扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

 

探针完整时，报告基团发射的荧光信号由于距离很近被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，消除淬灭基团对荧光基团的荧光吸收效应，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 

2)SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。实时荧光定量PCR 包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加， 染料类如SYBR Green I 则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加对病原DNA 的检测。Taqman探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针和模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

针对遗传病的基因突变，设计跨越突变位点的荧光探针，对跨越突变位点的一段基因进行扩增。扩增结束时，对产物进行缓慢加热以获得熔解曲线，根据熔解曲线判断是否有基因突变。肿瘤基因检测哪里做？

对某种基因型疾病实施药物治疗后，用实时荧光定量PCR 对相关基因是否转录或转录量的多少均可以快速准确的监控，对临床有重要指导意义。

癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就会出现， 实时荧光定量PCR不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，据此可进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
 

3)分子信标

是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。

PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

第二代PCR主要缺点：

灵敏度还有欠缺，低拷贝标本检测不准确。

存在背景值影响，结果易受干扰。

当反应体系中有PCR抑制物时，检测结果易受干扰。

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