【佳学基因检测】线粒体 疾病基因检测结果如何获得有效的治疗

线粒体基因检测如何指导线粒基因编辑从而实现线粒体病的精准治疗？

线粒体基因检测可以为线粒体基因编辑提供重要的指导，从而实现线粒体病的精准治疗。具体来说，线粒体基因检测可以帮助在以下几个方面进行指导：

确定致病基因和突变类型：线粒体基因检测可以帮助确定患者携带的致病基因和突变类型。这对于选择合适的编辑目标和制定编辑策略至关重要。不同的线粒体病可能由不同的基因突变引起，因此了解具体的突变类型有助于针对性地进行编辑治疗。

评估突变影响：线粒体基因检测可以帮助评估突变对线粒体结构和功能的影响程度。某些突变可能会导致线粒体功能障碍或代谢紊乱，而其他突变可能对线粒体功能影响较小。通过评估突变的影响，可以更好地确定编辑的优先级和目标。

指导编辑策略：根据线粒体基因检测结果，可以制定针对性的编辑策略。例如，针对特定基因的突变，可以选择合适的基因编辑技术和编辑器。此外，对于不同类型的突变，可能需要采用不同的编辑方法，如基因修复、基因替换或基因静默等。

监测治疗效果：线粒体基因检测还可以用于监测治疗效果。通过定期进行基因检测，可以评估编辑治疗的效果和持久性。如果检测结果显示突变负荷降低或病情改善，这将有助于确认治疗的有效性，并指导后续治疗方案的调整。

综上所述，线粒体基因检测为线粒基因编辑提供了重要的指导，有助于实现线粒体病的精准治疗。通过全面了解患者的基因突变情况，制定针对性的编辑策略，并监测治疗效果，可以更好地应用基因编辑技术进行线粒体疾病的治疗。

线粒体基因检测后的精准治疗

线粒体DNA（mtDNA）突变可能引发多种遗传病。近年来，mtDNA编辑技术作为一种新兴的治疗手段逐渐崭露头角，其基本原理主要基于蛋白质或核酸的识别靶点，尽管核酸识别型mtDNA编辑技术相对较少。代表性的蛋白质识别型mtDNA编辑技术包括锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应核酸酶技术和碱基编辑技术，在其研究中取得了一定的进展。然而，由于设计复杂的识别序列，这些技术在进一步推广应用时受到了一定的阻碍。

相比之下，CRISPR/Cas9等核酸识别型编辑技术因其结构简单、易于设计和修饰的特点而显示出显著的优势。然而，缺乏有效将核酸递送进入线粒体的方法限制了这些技术在mtDNA编辑领域的应用。随着对内源性和外源性核酸递送途径的研究以及对DNA修复机制的深入了解，越来越多的证据表明核酸递送是可行的，并且核酸识别型mtDNA编辑技术具有广阔的应用前景。

佳学基因检测为了更好地服务基因检测基因解码患者，总结了当前线粒体基因编辑技术的原理和发展现状，并展望了核酸识别型mtDNA编辑技术的潜在价值。这些技术的发展为精准治疗线粒体疾病提供了新的可能性，为改善患者的生活质量和治疗效果带来了希望。

线粒体疾病基因检测结果如何获得有效的治疗关键词

线粒体, CRISPR, 基因编辑, 核酸递送, 综述

线粒体病的发生原因及其精准治疗策略

线粒体作为细胞的能量和代谢中心，在调节细胞信号通路、呼吸作用、分解代谢和细胞凋亡等方面发挥着至关重要的作用。它是双层膜半自主性细胞器，内部含有独立于细胞核DNA（nDNA）的线粒体DNA（mtDNA）。由于活性氧等因素的作用，mtDNA的突变率比nDNA高出100倍。通常情况下，mtDNA的拷贝数在2至10个之间，其结构类似于质粒的双链环状结构。人类mtDNA的长度为16,569个碱基对，编码着37个基因，其中包括12S rRNA和16S rRNA、22种tRNA以及13种多肽。

mtDNA的突变可能导致线粒体代谢酶缺陷、ATP合成障碍和细胞能量不足，从而导致机体功能障碍。细胞内可能含有上万甚至十几万个mtDNA拷贝，当突变的mtDNA占比超出一定阈值时，就会出现临床症状。据已知，近90个致病性突变与mtDNA相关，每5000至10,000人中就可能有1人受到其影响。研究表明，几十种遗传性疾病，如线粒体肌病，与mtDNA的突变有关。由于母系遗传，携带突变mtDNA的女性很难孕育健康的孩子。主流的线粒体置换治疗虽然存在一定潜在风险，但也为解决线粒体遗传病提供了一种可能途径。然而，对于许多患者来说，传统药物治疗并不总是有效，因此需要寻求创新治疗手段。

随着各种新型编辑系统的不断涌现，mtDNA编辑技术逐渐得以发展。然而，受限于线粒体膜的特殊性和mtDNA修复机制，这些技术仍面临着一些挑战。目前，mtDNA编辑的主要方法是利用锌指核酸酶（ZFN）和类锌指核酸酶（TALEN）等蛋白质识别型编辑技术，将具有碱基序列识别能力的蛋白质引入线粒体内，然后在线粒体中进行编辑。与之相比，CRISPR技术等核酸识别型编辑技术由于其易于设计和修饰的特点而备受关注。然而，由于缺乏有效的核酸递送方法，这些技术在mtDNA编辑领域的应用受到限制。解决这一难题将有助于增强mtDNA编辑的广谱性，并为线粒体遗传病的治疗提供新的突破口。本文概述了各种成熟或正在开发中的以蛋白质或核酸识别靶点为基础的编辑技术在mtDNA编辑中的潜力，并评估了核酸识别型编辑技术在mtDNA领域中的发展前景。

图1：线粒体病的基因编辑治疗

ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等基因编辑工具通过MTS途径、亲脂性阳离子、物理手段、膜融合脂质体等方法导入线粒体后发挥功能，引发mtDNA的双链断裂现象或单碱基替换，再分别通过降解修复或切除修复降低突变mtDNA所占的比例，最终实现了mtDNA编辑过程. A：mtDNA编辑技术的模型. a：最原始的ZFN模型，融合表达了MTS、ZFP和Fok Ⅰ，MTS协助蛋白质进入线粒体后将被降解，ZFP识别特定的靶点基因，Fok Ⅰ具有核酸酶活性切割mtDNA；b：碱基编辑器技术，使用MTS协助蛋白质进入线粒体，TALE识别靶基因，DddA具有脱氨酶活性，可修改单个碱基；c：CRISPR-Cas9技术，使用MTS协助Cas9进入线粒体，但sgRNA进入线粒体的方法和效率仍在研究阶段. B：各种编辑工具进入线粒体可能的手段. C：编辑工具进入线粒体后通过一些修复机制实现突变mtDNA比例降低. MTS：线粒体靶向序列；ZFP：锌指蛋白；TALE：转录激活因子样效应器；DddA：双链DNA脱氨酶毒素A；CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列；Cas：CRISPR关联；sgRNA：小向导RNA；DSB：DNA双链断裂；ZFN：锌指核酸酶；TALEN：转录激活因子样效应核酸酶；mtDNA：线粒体DNA.

为什么线粒体病经过基因检测后可以进行基因编辑治疗？

基因编辑系统可以分为识别结构域和功能结构域两部分，根据识别结构域是蛋白质还是核酸分为两类，前者以ZFN与TALEN为代表，后者则是CRISPR技术。两类识别结构域与不同的功能结构域进行组合可以衍生出碱基编辑技术、PE技术等多种新兴技术。

蛋白质识别序列

RE技术

RE技术源于最初在大肠杆菌中发现的甲基转移酶和核酸内切酶，其特点是不携带识别元件。RE与甲基转移酶的识别序列相同，因此能够通过甲基化保护序列免于切割。由于线粒体膜的特殊性，RE要进入线粒体需要与线粒体定位信号（MTS）融合表达，而MTS能够被细胞质分子伴侣MSF识别，从而成功将RE带入线粒体内。突变的mtDNA往往会产生新的酶切位点，RE能够识别并切割突变的mtDNA，从而降低突变比例。mitoPstI是第一个用于哺乳动物线粒体的RE，随后SmaI被调整用于切割与NARP综合征和亚急性坏死性脑脊髓病相关的mtDNA突变位点。然而，RE存在着靶点限制性的问题，因为mtDNA上包含大量与目标无关的序列可被切割。治疗效果极度依赖于RE本身的精度，因此存在着可能导致脱靶效应的风险。因此，开发更加精准和安全的mtDNA编辑技术迫切需要解决靶点特异性的问题，需要寻找具有序列识别功能，能够定位到特定基因的元件。

ZFN技术

ZFN技术利用DNA识别域和DNA剪切域来实现其功能。DNA识别域通常由三或四个锌指结构域串联组成，也称为锌指蛋白，而DNA剪切域则是核酸内切酶FokⅠ。锌指蛋白广泛存在于真核细胞中，其骨架具有保守的β-β-α二级结构，最常见的DNA结合基序为Cys2-His2-锌指。锌指蛋白通过疏水相互作用以及Cys和His与锌离子的配位来保持稳定。然而，锌指蛋白的重复次数和连接子长度存在很大差异。FokⅠ包含有分子量为41,000的氨基端识别结构域和分子量为25,000的羧基端裂解结构域，该酶在镁离子的辅助下与DNA结合后会形成二聚体并具有催化活性。ZFN技术已成功应用于mtDNA编辑，通过MTS和NES能够帮助ZFN靶向线粒体，并同时降低对nDNA的损伤，FokⅠ则切割mtDNA后诱导受损DNA的降解。

锌指蛋白的特异性和FokⅠ的核酸毒性对ZFN技术影响巨大。锌指蛋白的单个α螺旋需要同时识别3~4个碱基位点才能发挥作用，而获取特异的锌指蛋白增加了设计难度，其低灵活性和高复杂性在一定程度上限制了其应用。FokⅠ可能存在潜在的脱靶核酸毒性，例如同源二聚体或在特殊情况下单体引发的核酸切割。此外，ZFN技术的递送形式和免疫原性也是其发展受限的重要因素之一。研究人员进行了一些改进，例如Minczuk等人对FokⅠ进行了改良，添加了两个柔性接头，有效减少了同源ZFN误识别引起的mtDNA脱靶效应。然而，长片段缺失突变难以识别，并且存在较强的组成性细胞毒性。另一方面，Gammage等人调整了元件顺序，试图通过强制ZFN异源二聚来降低脱靶率。他们使用腺相关病毒递送的全身给药线粒体ZFN成功诱导了心脏突变mtDNA的特异性消除。这些优化措施极大地推动了ZFN技术的发展，但锌指蛋白设计的复杂性仍然限制了其应用。

TALEN技术

TALEN技术由TALE蛋白和FokⅠ酶组成。TALE蛋白主要包括中心结构域的串联重复序列、核定位信号和酸性转录激活结构域。中心结构域由33~35个氨基酸组成的重复单元构成，也是DNA结合域。串联重复序列高度保守，其中第12和第13个氨基酸是可变区，其中第12号残基起到稳定结构的作用，而第13号残基则负责特异性识别碱基。每个重复序列对应于一个核苷酸，通过实验和计算的方法来解析，通常C、T、A被HD、NG、NI所识别。

在用于mtDNA编辑时，TALEN也需要通过MTS进行修饰。已经设计的TALEN用于识别并敲除m.C5024T突变，而mito-TALEN也被用于阻断线粒体疾病的代际传播。Bacman等研究者发现，在处理后，14459A-mito-TALEN使得正常mtDNA的百分比增加到85%和90%。通过腺相关病毒9-mito-TALEN的肌内、静脉内和腹膜内注射给药，研究者大大减少了突变mtDNA的负荷。

相比锌指蛋白，TALE具有更高的特异性，能够特异性识别碱基。然而，构建长串TALE所需的重复序列之间的联系成为难点。目前，实现快速组装自定义TALE的策略包括“金门”分子克隆、高通量固相组装和连接非依赖性克隆技术等。然而，与锌指蛋白类似，固有的设计复杂性始终限制了TALEN技术的深入发展。此外，复杂的设计和长串的序列也导致mito-TALEN具有更大的分子量，从而阻碍了病毒的包装、细胞和线粒体的进入。TALEN技术也存在脱靶现象、费用昂贵且费时、可能会引起机体免疫反应等问题。

碱基编辑技术

ZFN和TALEN不能应用于同质mtDNA突变，因为破坏所有mtDNA是有害的，细菌基因组含有的脱氨酶为精确编辑提供了可能。细菌脱氨酶是一类细菌毒素，往往识别ssDNA，胞苷脱氨酶DddA则能作用dsDNA。DddA与载脂蛋白B mRNA编辑酶具有同源性，载脂蛋白B mRNA编辑酶有一个保守的胞苷脱氨酶折叠区域，保守的Cys、His、Glu残基及锌离子激活的水分子参与胞苷环亲核攻击和质子穿梭［40］。DddA则有一个中央β片封闭活性位点，某个螺旋上的E1347和H1345可能发挥了类似的功能，区别是羧基末端的β链呈现反平行。DddA对5 ´ -TC上下游序列具有强烈偏好性，尿嘧啶DNA糖基化酶移除尿嘧啶后启动碱基切除修复。

碱基编辑技术即基于脱氨酶偶联锌指蛋白或TALE。Willis等报道的锌指-DdCBE即通过改进锌指支架和改造DddA增强活性而来，但脱靶效应较为严重。Mok等构建的DdCBE可实现mtDNA靶点C-T的转换。Lee等新加入尿嘧啶糖基化酶抑制剂元件保护尿嘧啶稳定存在，其编辑效率提高了8倍。刘如谦团队统计结果显示，DdCBE可以修复49%已知的线粒体有害基因突变；但伊成器团队提出MTS本身的局限性会引起入核脱靶效应，TALE存在序列依赖性脱靶编辑。锌指蛋白CTCF可与凝集蛋白相互作用并参与维持nDNA的三维结构，受CTCF结合位点共定位干扰，DdCBE还存在TALE序列非依赖性脱靶编辑现象［45］。诚然，使用NES、DddIA、Q1310A突变体等改造手段可减少脱靶效应，但MTS导入法也暴露出入核脱靶的风险。

综上，以蛋白质作为识别元件的编辑器较为成熟，且在mtDNA编辑中得到一定程度的应用，当然也存在脱靶效应、免疫原性和设计复杂等缺陷。随着技术不断迭代升级，锌指蛋白和TALE技术的优化也趋于饱和，其靶向性已经能够满足一般需求，研究人员将更关注对效应元件进行改造，以增强技术安全性和精确性。

1.2. 核酸识别序列

1.2.1. CRISPR/Cas9技术 CRISPR/Cas9技术主要由Cas9蛋白和sgRNA组成。Cas9是一种核酸酶，能够切割dsDNA，sgRNA能结合Cas9并特异性识别靶基因，Cas9在sgRNA引导下能特异性切割靶序列［30］。CRISPR系统是细菌和古细菌用于抵抗外源DNA入侵的免疫系统，由许多短而保守的重复序列区和间隔区组成。重复序列含有回文序列，可以形成发夹结构，间隔区来源于细菌捕获的外源DNA序列，具有特殊性［48］。CRISPR/Cas9技术主要过程是sgRNA与Cas9结合改变构象，产生DNA通道，Cas9/sgRNA复合体识别靶链PAM区域促进DNA解旋，sgRNA与靶序列互补形成RNA-DNA杂交链，Cas9切割靶序列［49］。CRISPR/Cas9本身只介导DNA双链断裂，通过NHEJ和HDR等完成基因编辑。

CRISPR/Cas9技术已被广泛用于nDNA编辑、产生突变的疾病模型或纠正特定疾病的等位基因，用于mtDNA编辑也如火如荼。Jo等［50］使用mito-Cas9进行mtDNA编辑，但观察到线粒体蛋白质稳态和膜电位遭到破坏。Bian等［51］展示的mito-CRISPR/Cas9系统成功将一个具有短同源臂的外源单链DNA精确地敲入靶位点。Bi等［52］建立的mito-Cas9系统用MTS和3 ´ -UTR有效介导了mRNA的线粒体定位，验证了mito-Cas9系统介导mtDNA中的同源定向修复。CRISPR/Cas9是比较成熟的技术，然而由于核酸导入线粒体尚无高效手段，且线粒体缺乏HDR和NHEJ，在mtDNA编辑领域推广应用仍需继续积淀相关技术。

1.2.2. 碱基编辑技术 Cas9突变会形成丧失核酸酶活性但保留结合gRNA能力的dCas9或nCas9蛋白。dCas9能够融合表达脱氨酶等多种功能性蛋白，其强大的兼容性在基因编辑领域迅速占据了一席之地，最为经典的模型便是碱基编辑技术。Cas9系统擅长基因敲除，对基因插入则略显乏力，而对于单个碱基的编辑更是束手无策。由于碱基之间的差异往往是氨基、羰基、甲基等的差异，脱氨酶具有更改单个碱基的能力，融合表达dCas9和脱氨酶从而具有碱基编辑潜能。迄今，已经开发的两类主要碱基编辑技术是CBE和ABE，可以有效地介导所有四种可能的转换突变，覆盖目前已被注释的人类致病变异的30%［53］。Gaudelli等［54］报道了CBE系统实现C-T或G-A的转换，2017年又开发了ABE系统实现A-G或T-C的转换［55］，目前通过碱基编辑技术可将dCas9融合到ssDNA脱氨酶上，在某些情况下，还与操纵DNA修复机制的蛋白质融合。

碱基编辑的多样性增加了选择的复杂性，影响适配性的因素众多，包括PAM可用性、靶点上下游特征序列、编辑窗口、产品纯度和DNA特异性等［56］。核酸识别型的碱基编辑技术基本没有用于mtDNA研究，原因在于sgRNA尚不能稳定进入线粒体。碱基编辑技术固然具有编辑效率高、损伤少等优势，但仍有可能发生严重的脱靶效应，如额外产生的旁观者脱靶效应。此外，脱氨酶本身具有潜在的毒性或致癌性。因此，碱基编辑技术仍有待进一步发展。

1.2.3. PE技术鉴于碱基编辑技术可能触发旁观者脱靶效应等，也为了进一步增强靶向性，PE技术应运而生。Anzalone等［57］向dCas9系统引入逆转录酶实现12种单个碱基的转换，降低了脱靶效应。PE技术是结合Cas9切口酶结构域和工程逆转录酶结构域的融合蛋白，pegRNA负责识别靶点，Cas9切开靶链，pegRNA作为模板引发逆转录。新生的ssDNA与原序列竞争结合引发DNA修复。原始链倾向于被清除，新片段将优先整合入原序列中，实现基因编辑［58］。

PE技术在nDNA编辑领域发展显著：PE1由nCas9与M-MLV RT融合而构建；PE2将突变引入M-MLV RT构建了五突变体M-MLV RT，其编辑效率提高3倍；PE3使用额外的sgRNA诱导未编辑链上的切口以触发内源性错配修复途径，其编辑效率进一步提高2~4倍［57］。Böck等［59］开发的尺寸减小型SpCas9 PE技术显示出治疗苯丙酮尿症的潜力。Petri等［60］则报道了PE技术通过借助核糖核蛋白复合体递送可以提高编辑发生频率。

当然，PE技术并非完美，pegRNA的降解会阻碍编辑效率，Nelson等［61］在3 ´ 末端融合了结构化RNA基序增强了其稳定性，编辑效率提高了3~4倍。由于RNA接头具有序列依赖性，他们开发的pegLIT计算工具（pegRNA接头识别工具）能减少来自epegRNA接头干扰。此外，他们发现使用化学合成和修饰的epegRNA也能增强效果。PE技术已在多种人类细胞系和小鼠神经元［62］、胚胎等进行了测试，多种哺乳动物细胞类型均可使用PE技术，但其效率差异悬殊［57］。后续研究又发现DNA错配修复会干扰PE发挥功能，诱导产生多余的插入或缺失副产物。Chen等［63］通过引入MLH1dn开发出PE4和PE5，瞬时抑制错配修复实现更高的编辑效率，相比PE2和PE3分别提升了7.7和2.0倍；对相关蛋白优化后开发出PEmax，能够与PE4和PE5系统以及epegRNA协同作用，其编辑效率提升2.8倍。PE技术的pegRNA因其兼具了模板功能，相比sgRNA具有更高的复杂度。而Standage-Beier等［64］开发的软件工具PINE-CONE可实现pegRNA和PE技术策略的自动高通量设计，提升pegRNA设计的效率。

PE技术适用性极度广泛，PAM与靶点之间的距离更灵活，增强了靶向性。因为逆转录模板的序列决定了编辑的DNA的序列，因此很少脱靶。当然，PE的编辑效率相比之下也略低一些。也有研究人员提出，逆转录酶可能具有潜在危害，而且PE技术在不同细胞类型的兼容性尚未得到广泛验证。

1.2.4. pAgo pAgo系统是通过原核细胞内的Argonautes将DNA充当引导核酸来行使DNA核酸酶功能。Argonautes是一个多样化的核酸引导蛋白家族，pAgo利用引导DNA的靶向互补DNA序列保护宿主免受外源DNA入侵，真核生物Argonautes则与RNA诱导沉默复合体参与的RNA干扰具有相关性。

Ago蛋白一般具有四个结构域，即MID、PIWI、PAZ、N结构域，其结构和功能很保守［65］。MID结构域识别和结合靶基因，其含有保守芳香族氨基酸或特定环状结构的核苷酸结合口袋，识别5 ´ -磷酸基团特定的5 ´ -碱基［66-67］。PIWI结构域类似于核糖核酸酶H的折叠结构，活性位点的DEDX或DDK基序依赖锰离子等二价阳离子协调催化［68-70］。PAZ结构域具有序列识别特异性的SH3样桶折叠结构，与引导链3 ´ 端相互作用引导和固定MID，保护引导核酸不被降解［71-72］，随后引导链与PAZ结构域保守的Arg相互作用启动碱基配对［73］。N结构域参与靶标断裂，根据复合物的状态在靶标结合和切割过程中起到楔形作用［74］。楔入机制分为主动楔入和被动楔入，前者通过伴侣机制和ATP水解驱动直接切割，后者依赖碱基错配或G·U摆动诱导，无驱动自发形成［75-77］。简而言之，pAgo发挥功能是通过MID结构域与PAZ结构域对引导链进行识别和固定，诱导引导链与靶链精确结合。随后PIWI结构域发挥核酸酶功能切割对应核酸片段，最后N结构域以主动楔入或被动楔入的机制顺利分离引导链。

早期发现的pAgo来自嗜热原核生物，如TtAgo（Thermus thermophilus）［78］、PfAgo（Pyrococcus furiosus）［79］、MpAgo（Marinitoga piezophila）［80］和MjAgo（Methanocaldococcus jannaschii）［81］等利用向导DNA或gRNA在高温下切割DNA片段；CbAgo（Clostridium butyricum）［82］、LrAgo（Limnothrix rosea）［82］、SeAgo（Synechococcus elongatus）［83］、KmAgo（Kurthia massiliensis）［84-85］、CpAgo（Clostridium perfringens）［85］和IbAgo（Intestinibacter bartlettii）［85］可以在中等温度下切割ssDNA或dsDNA，其中来自人肠道细菌的CpAgo还可以对RNA靶向切割，具有哺乳动物细胞基因编辑的潜力。Li等［86］报道了首个常温下偏好切割RNA的MbpAgo，这种pAgo从耐寒菌中筛选出来，在4~65 ℃都很活跃。这意味着自然界中也存在种类繁多的能在适宜温度下发挥功能的pAgo。

目前已经发现一些pAgo能够被质粒衍生出的mRNA引导用于编辑质粒DNA，减少报告基因的转录和质粒含量［83］，基于mtDNA与质粒DNA在结构上的相似性，这为线粒体编辑提供了新思路。设计一段具有一定长度的正常mtDNA序列的同源臂以指导新一轮复制过程中突变DNA序列向正常DNA的转化，有利于通过基因编辑抢救和恢复受损的线粒体。这种原核细胞与真核细胞都相似的系统可能具有更强的兼容性和靶向性，具有线粒体编辑工具开发的潜能。

综上，Cas9系列技术最为成熟，展示出核酸型识别元件的优越性，主要体现在易于设计和特异性更强，但也存在难以有效递送进入线粒体的致命缺陷。双链断裂也许并非mtDNA编辑的最佳手段，碱基编辑技术和PE技术精确针对靶向点突变，无需双链断裂或供体DNA模板或HDR，依托于dCas9或nCas9系统，其靶向原理与Cas9系统具有同质性，因此在线粒体中开发利用的原则也基本一致。gRNA进入线粒体的效率是Cas9系列技术应用于mtDNA编辑的关键因素。pAgo展现出ssDNA或RNA指导下的DNA剪切功能，但pAgo的剪切主要针对ssDNA，对基因组的编辑能力有限。同时，pAgo对靶标序列无PAM基序等限制，具有更广泛的编辑潜力。对pAgo作用机制的研究有利于开发广谱基因编辑工具和作为CRISPR/Cas9技术发展的补充。应用于mtDNA同样需要克服递送线粒体困难的核酸识别型mtDNA编辑技术的共性问题。

2. 核酸识别型线粒体DNA编辑技术的广阔前景

2.1. 核酸类识别元件的优越性

RE、Cas、DddA等主流切割元件本身具有组成性活性，RE和Cas以双链断裂作为主要编辑手段，但HDR发生概率低导致插入基因能力也有限。脱氨酶类的切割元件作为细菌毒素则有潜在致癌性，也有旁观者脱靶效应。

锌指蛋白、TALE、gRNA、ssDNA等均能充当识别元件。锌指蛋白与TALE同属于蛋白质，锌指蛋白识别精度相对较差，但一个模块能够识别三个特定碱基，这赋予它较小的开放阅读框负载。TALE能够识别单个碱基从而具有更灵活的位点选择性，但其阵列的分析与构建更为复杂，每次更换位点都需要从头构建，这为研究者带来了极大的负担，甚至难以得到有效的结构。gRNA作为核酸识别元件具有高度特异性，其易于设计的特点相比锌指蛋白和TALE复杂的结构具有独特的优越性。毕竟无论是RNA或是ssDNA，其基本组成均为四个碱基，而蛋白质则含有20种常见氨基酸，后者对算力的需求远大于前者。诚然，脱靶效应仍是不可避免的，但由于结构简单，其序列优化难度远低于蛋白质。RNA易降解的特性也许一定程度上限制了使用，但这也避免了细胞内积聚。过量的编辑工具在线粒体中积聚显然并不合适，更短的半衰期能预防基因编辑工具过量囤积，线粒体擅长降解修复的特性可能进一步放大基因编辑工具滞留的危害。gRNA和靶DNA形成双链体的稳定性可以反映出gRNA的识别效率［87］，相比蛋白质这种核酸之间结合的稳定性可能更好。细胞天然存在DNA-DNA与DNA-RNA组成性配对，而蛋白质则需要结合靶点的实际序列寻找匹配的氨基酸组合。此外，核酸简单的结构赋予其更易被修饰的特性，具有更大的灵活性。

2.2. 核酸类识别元件的可行性

mtDNA编辑系统需要考虑核酸和蛋白质通过线粒体膜的能力，MTS基本解决了锌指蛋白和TALE等外源蛋白质难以进入线粒体的问题，但仍然存在入核脱靶现象，需要对各种细节优化研究。CRISPR技术在mtDNA编辑领域应用不如在nDNA编辑领域，线粒体对gRNA的屏蔽限制了mito-Cas9、线粒体碱基编辑器和PE等mito-CRISPR技术发展。mito-CRISPR系统应用于mtDNA编辑的最大瓶颈便是gRNA导入线粒体的机制，一般RNA导入法挽救线粒体仅限于纠正线粒体tRNA突变引起的缺陷，这个过程往往引入外源蛋白质因子或将多亚基聚集体移入，效率低下且兼容性较低难以复制。Wang等［88］设计的人线粒体tRNA和mRNA可以有效靶向线粒体，最后通过线粒体中的正常途径降解。

对RNA导入线粒体内在机制的研究有利于推动核酸识别靶点型编辑器在mtDNA中应用。RNA的类型具有多样性，结构也复杂多变，对特殊RNA的研究逐渐彰显出优越性。Kolesnikova等［89］发现酵母细胞质 tRNALysCUU （tRK1）的F臂和D-发夹结构域具有特殊性；持家基因表达的烯醇化酶不仅参与糖酵解，还促进tRNA靶向线粒体，部分tRNA能够形成稳定的新F臂结构，得以导入线粒体。考虑到mtDNA能够编码tRNA，真核生物tRNA可能存在潜在的线粒体识别区域，对mtDNA基因编辑技术发展具有指导意义。同时，Smirnov等［90］证明了人类5S rRNA通过两个区域实现线粒体靶向，其中一个位于螺旋Ⅰ的近端，包含一个保守的无补偿G：U对，另一个是更重要的环E-螺旋Ⅳ区（γ域），而β结构域的缺失不影响功能，因此β域改造后的5S rRNA作为载体具有携带外源RNA进入线粒体的潜能。此外，lncRNA在细胞内多个结构中出现并发挥了重要功能，同样具有进入线粒体发挥功能的能力。如细胞膜脂结合LINK-A促进细胞质膜PIP3-AKT信号转导［91］，细胞质CamK-A介导钙离子信号与NF-κB信号交互［92］，细胞核BCAR4介导了Hedgehoge-Hippo信号协同转录［93］。Sang等［94］通过绘制细胞器lncRNA图谱，揭示了线粒体lncRNA GAS5介导三羧酸循环代谢区室解离中的重要调控作用，具有线粒体定位的GAS5为RNA线粒体定位的内源性途径研究提供了崭新视角。

tRNA、rRNA与lncRNA均可成功进入线粒体，预示gRNA有通过内源性途径进入线粒体的潜能。除此之外，也可通过外源性途径导入，如纳米粒和药物递送方法。Yuan等［95］报道了使用可生物降解的二氧化硅纳米粒将天然蛋白质和抗体递送到线粒体。Haddad等［96］设计的靶向线粒体的金属有机物框架成功将药物定位于线粒体。外源性途径导入策略对线粒体基因病的治疗策略有一定的借鉴意义。由于mtDNA具有异质性，很多时候发病机制源于突变mtDNA的比例超出阈值，因此通过提高正常mtDNA比例来抑制突变mtDNA发挥致病性不失为一种治疗策略。Kawamura等［97］开发了线粒体递送的脂质体载体mito-Porter，成功将野生型mtDNA pre-tRNAPhe转染入线粒体tRNA具有G625A异质突变的细胞，经过数轮mtDNA复制，有效降低了突变mtDNA的比例。当然，这种手段不能忽视外源性mtDNA和递质载体潜在的免疫原性，同时mtDNA的递送手段也是该项技术的重点和难点。目前，对于线粒体递送技术领域的发展，除了基于MTS的生物学靶向法，还存在亲脂性阳离子靶向、物理手段递送、膜融合脂质体等三个分支［98］。亲脂性阳离子能够与强负电位的线粒体内膜相互作用，物理手段包括电穿孔和流体动力注射法等，膜融合脂质体则可以顺利进入线粒体膜间隙或基质中。mtDNA的实质也是核酸，这些技术的迅猛发展逐渐为基于核酸识别靶点的mtDNA编辑技术开辟了新思路。

2.3. mtDNA修复机制的特殊性

mtDNA相比nDNA具有更高的突变概率，这与线粒体长期的氧化内环境有关，活性氧副产物产生和保护性组蛋白缺乏等因素均促进了mtDNA突变，其修复机制因此也具有一定的特殊性。mtDNA的修复与nDNA在种类上并无不同，碱基切除修复、错配修复、单链断裂修复、双链断裂修复等基本修复机制在mtDNA中均有发现［99］。但在频率上mtDNA显著不同，HDR和NHEJ途径极少发生，甚至在学术界对其是否存在尚无统一定论。多数情况下，得益于高拷贝数，mtDNA修复倾向于直接暴力降解以降低突变mtDNA比例。而即使不使用降解法，主流的修复机制也是采取碱基切除修复，如先后发现的SP-碱基切除修复［100］和LP-碱基切除修复［101］。传统的手段无论是ZFN、TALEN或Cas系统均通过产生双链断裂引发mtDNA降解实现突变mtDNA负荷下降，受限于HDR和NHEJ的缺乏，基于双链断裂诱导基因插入的编辑技术显得后继乏力。新型的碱基编辑技术和PE技术则跳过双链断裂修复机制的局限性，碱基编辑技术利用脱氨酶等直接作用于碱基实现点突变，PE技术则弥补了碱基编辑技术旁观者脱靶效应的劣势，携带模板链启动逆转录诱导点突变，最终前者通过碱基切除修复实现基因编辑，后者的修复机制尚不明确，但与错配修复具有强相关性。

值得注意的是，碱基编辑技术主要是实现嘌呤或嘧啶的内部转换，鸟嘌呤之外的颠换则难度较大，这是由于脱氨酶催化后产生的次黄嘌呤或尿嘧啶被切除后将形成AP位点，碱基切除修复倾向于填补鸟嘌呤［102-103］。尽管当前也有不少颠换型碱基编辑技术的例子，如Chen等［104］开发的ACBE-Q可以实现A-C颠换，但其编辑产物的纯度偏低。而PE技术无需理解碱基切除修复触发的碱基插入AP的倾向性，因为PE技术携带模板启动编辑，但错配修复可能会干扰PE技术产生额外编辑。碱基编辑技术与PE技术各有千秋，区别在于PE技术通常以核酸作为识别元件而碱基编辑技术则没有限制。此外，碱基编辑器需要克服脱氨酶的组成毒性，而PE中逆转录酶的潜在危害尚未得到有效论证。PE技术的独到之处也折射出核酸作为识别元件在基因编辑领域的优势可圈可点，展现出应用于mtDNA编辑的前景。

线粒体疾病基因检测结果如何获得有效的治疗

mtDNA编辑治疗遗传病的本质在于将nDNA编辑工具引入线粒体内以发挥功能。目前，几乎所有的mtDNA编辑技术都基于蛋白质识别靶点，这主要是因为MTS技术相对成熟。然而，就识别元件本身而言，核酸实际上比蛋白质更适合识别靶点。靶点本身就是一段核酸，因此以核酸去识别具有更强特异性。此外，核酸，尤其是RNA，具有更简单和柔性的结构，这使得它更易于被设计、改造和优化。RNA的较短半衰期也避免了识别元件在线粒体内大量堆积的风险。因此，基于核酸识别靶点进行mtDNA编辑无疑是一项重大的技术突破。

然而，核酸识别型mtDNA技术的发展面临着诸多挑战，尤其是递送进入线粒体的技术。目前，研究表明tRNA、rRNA和lncRNA等特殊RNA具有内源性进入线粒体的能力，而阳离子脂质体、电穿孔等技术则提示了核酸外源性导入线粒体的可能性。研究针对线粒体递送的内源或外源性途径将有助于开发sgRNA导入线粒体的有效手段，推动CRISPR技术与mtDNA编辑的结合。由于mtDNA修复机制的特殊性，双链断裂降解修复的高发性可能对线粒体造成较大的损伤，而线粒体HDR和NHEJ的缺乏使得基因插入变得困难。碱基编辑技术和PE技术具有一定的潜力，但碱基编辑技术需要克服碱基切除修复引起的碱基随机插入，而PE技术则需要解决错配修复引起的错误编辑问题。另一种间接插入基因的形式是直接导入野生型mtDNA，但这需要合适的递送方式。pAgo作为原核生物来源，也许在线粒体内具有特殊性，对pAgo的研究也许有助于更深入地理解核酸识别型mtDNA编辑。

综上所述，mtDNA编辑治疗线粒体遗传病是未来的一个发展方向，但mtDNA修复机制的特殊性影响了nDNA编辑技术的兼容性，而线粒体的天然膜屏障也增加了mtDNA编辑的难度。目前开发的一些mtDNA编辑技术主要以蛋白质识别靶点为基础，但核酸识别靶点的高特异性和低复杂性使其更适用于mtDNA编辑。对内源性和外源性递送途径的研究无疑会进一步提升其潜在的应用价值。相信随着对核酸递送机制的深入探索，核酸识别型mtDNA编辑技术有望成为mtDNA编辑的新前沿。

(责任编辑：佳学基因)

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